lisosomal

Apr 13, 2023

Nature Communications volumen 14, Número de artículo: 2654 (2023) Citar este artículo

1064 Accesos

3 Altmetric

Detalles de métricas

La esteatohepatitis no alcohólica (EHNA) ha recibido gran atención debido a su alta incidencia. Aquí, mostramos que la proteína transmembrana 5 asociada a lisosomas (LAPTM5) está asociada con la progresión de NASH a través de un extenso análisis bioinformático. El nivel de proteína de LAPTM5 tiene una correlación negativa con la puntuación NAS. Además, la degradación de LAPTM5 está mediada a través de su modificación de ubiquitinación por la ubquitina ligasa E3 NEDD4L. Descubierto por experimentos realizados en ratones machos, el agotamiento específico de hepatocitos de Laptm5 exacerba los síntomas de NASH en ratones. Por el contrario, la sobreexpresión de Laptm5 en los hepatocitos ejerce efectos diametralmente opuestos. Mecánicamente, LAPTM5 interactúa con CDC42 y promueve su degradación a través de una forma dependiente de lisosomas bajo la estimulación del ácido palmítico, lo que inhibe la activación de la vía de señalización de la proteína quinasa activada por mitógeno. Finalmente, la sobreexpresión hepática de Laptm5 mediada por adenovirus mejora los síntomas antes mencionados en los modelos NASH.

La esteatohepatitis no alcohólica (EHNA) se caracteriza patológicamente por esteatosis hepática, hepatocitos balonizados, inflamación lobulillar y hepática y fibrosis intersticial1,2. Como causa principal culpable de la progresión de la cirrosis y el carcinoma hepatocelular (CHC), la EHNA representa una de cada cinco personas con enfermedad del hígado graso no alcohólico (EHGNA) y se estima que afecta aproximadamente al 25 % de la población adulta mundial según estudios recientes. informes3,4. Desafortunadamente, las medidas terapéuticas efectivas para proteger contra el desarrollo y la progresión de NASH siguen siendo limitadas y, hasta el momento, no se dispone de una terapia farmacológica aprobada por la FDA5,6. Las dianas moleculares de NASH han atraído una creciente atención debido a su buena perspectiva de aplicación terapéutica7.

En los últimos años, el papel de la regulación relacionada con los lisosomas en la progresión de la enfermedad ha sido objeto de estudios activos. De hecho, según los informes, los lisosomas no solo funcionan para degradar y reciclar los desechos celulares, sino que también son orgánulos clave que están implicados en la degradación de proteínas, la detección de nutrientes, la inmunidad innata y adaptativa8,9. Y hasta ahora se ha demostrado que los lisosomas interactúan con múltiples vías de señalización y regulan la progresión de una serie de enfermedades, como la aterosclerosis, las enfermedades de neurodegeneración, los trastornos autoinmunes y el trastorno de almacenamiento lisosomal. Mientras tanto, se cree que la degradación de proteínas modulada por el sistema de proteostasis es una plataforma atractiva para el direccionamiento de fármacos y que desempeña un papel importante en una amplia gama de actividades fisiológicas humanas10,11.

La familia LAPTM, que consta de LAPTM4A, LAPTM4B y LAPTM5, se ha estudiado intensamente en los últimos años debido a sus funciones en el transporte de proteínas y la degradación de los lisosomas y puede servir como un objetivo especial para la intervención de enfermedades. La proteína transmembrana 5 asociada a lisosomas (LAPTM5) pertenece a la familia de proteínas transmembrana endosomal/lisosomal tardía12, y se identificó inicialmente como un regulador de la homeostasis proteica13,14 y un modulador de las vías de señalización inflamatorias15. LAPTM5 mejora la hipertrofia cardíaca al modular la actividad de la vía de señalización MAPK16. Nuestra investigación anterior17,18 y los estudios realizados por otros investigadores19,20 demostraron que la activación de la vía de señalización de MAPK estaba íntimamente relacionada con el desarrollo y la progresión de NASH. Basado en algunos hallazgos preliminares, este estudio se realizó con la hipótesis de que LAPTM5 está involucrado en la progresión de NASH.

En este estudio, demostramos que la expresión de la proteína LAPTM5 estaba significativamente regulada a la baja en los hígados de sujetos humanos con NASH y modelos de NASH de ratón. El agotamiento de LAPTM5 en los hepatocitos exacerbó significativamente la esteatosis hepática, la inflamación y la fibrosis en modelos de NASH de ratón inducidos por una dieta alta en grasas y colesterol (HFHC), mientras que la sobreexpresión de LAPTM5 en los hepatocitos retrasó y mitigó sustancialmente los cambios patológicos anteriores. Además, descubrimos que LAPTM5 podría interactuar directamente con la proteína Ciclo de división celular 42 (CDC42) y la sobreexpresión de LAPTM5 promovió la degradación lisosomal de la misma en las circunstancias de la estimulación con ácido palmítico. Por otro lado, la expresión de CDC42 aumentó significativamente cuando disminuyó la expresión de LAPTM5, lo que se ha confirmado en tejidos NASH humanos y murinos. Como resultado, el efecto protector de LAPTM5 sobre el depósito y el metabolismo de los lípidos en los hepatocitos y la inhibición de la activación de la vía de señalización de MAPK podrían suprimirse significativamente por la sobreexpresión de CDC42. Además, la deposición de lípidos en los hepatocitos debido a la desactivación de LAPTM5 fue significativamente suprimida por la desactivación de CDC42, lo que sugiere que LAPTM5 regula la progresión de NASH al modular la expresión de la proteína de CDC42 para mediar la actividad de la vía de señalización de MAPK. La terapia mediada por adenovirus también podría mejorar considerablemente los síntomas de NASH. En conjunto, estos hallazgos revelaron que, mecánicamente, LAPTM5 actúa como un regulador de la progresión de la NASH y, clínicamente, también podría servir como un indicador de la progresión de la NASH y un objetivo para el tratamiento de la NASH.

Si bien la NASH es fisiopatológicamente complicada y multifactorial, se ha encontrado que un gran número de proteínas están involucradas en la regulación de la NASH. Para saber qué proteínas son los determinantes más críticos en la patogenia de NASH, buscamos en 10 bases de datos clínicas de RNA-Seq de muestras de hígado de sujetos con NASH y recuperamos tres proteínas conservadas, presentes en los lisosomas, ciertos gránulos y la luz granular azurófila, que se incluyen en las 10 bases de datos clínicas (Fig. 1a-c). Es de destacar que la gravedad de la enfermedad está más estrechamente relacionada con la expresión de proteínas localizadas en el lisosoma (Fig. 1d). Los resultados de la búsqueda en 5 bases de datos de RNA-Seq de hígados de ratones también confirmaron esta conclusión (Fig. 1e). Dada la importante función de las proteínas transmembrana en la progresión de la enfermedad21,22,23, 71, se identificaron proteínas transmembrana entre las proteínas asociadas a los lisosomas mencionadas anteriormente. Se realizó un análisis de detección de alto contenido para evaluar el efecto de estos genes en los perfiles de lípidos y los resultados mostraron que LAPTM5 tenía el efecto inhibidor más fuerte sobre la acumulación de lípidos en los hepatocitos tras la estimulación con PA (Fig. 1f). Para investigar la correlación entre LAPTM5 y NASH, primero determinamos la expresión de proteína de LAPTM5 en el hígado de sujetos humanos sin esteatosis o con NASH, se encontró que los niveles de proteína LAPTM5 hepática estaban significativamente regulados a la baja en los pacientes con NASH que en sus pacientes sin esteatosis. - Contrapartes de NASH (Fig. 1g y Fig. 1a, b complementaria). En combinación con los resultados de la inmunohistoquímica, encontramos que los niveles de proteína de LAPTM5 se correlacionaron negativamente con la puntuación NAS (Fig. 1h, i). De acuerdo con nuestra observación en humanos, la expresión de la proteína LAPTM5 se redujo significativamente en los hígados de ratones ob/ob y ratones de tipo salvaje con una dieta alta en grasas (HFD), dieta alta en grasas y colesterol (HFHC) o metionina y dieta deficiente en colina (MCD) (Fig. 1j y Fig. 1c-e complementaria). Además, los experimentos in vitro demostraron que la expresión de la proteína LAPTM5 disminuyó drásticamente de manera dependiente del tiempo tanto en hepatocitos humanos L02 como en hepatocitos primarios de ratón después del tratamiento con PA (Fig. 1f, g complementarias). Posteriormente, la qPCR detectó la expresión génica de Laptm5 en NASH o no NASH y el resultado mostró, inesperadamente, que los niveles de ARNm de Laptm5 eran comparables en los modelos in vivo e in vitro, lo que indica que LAPTM5 estaba regulado postranscripcionalmente en respuesta a la estimulación metabólica (Fig. 1h-j complementaria). En conjunto, la sorprendente correlación negativa entre la expresión de LAPTM5 y el desarrollo de NASH sugiere que LAPTM5 juega un papel en la progresión retrasada de la enfermedad.

a El GSE derivado de RNA-seq de hígados humanos de pacientes clínicos con EHNA y los pacientes sanos o con obesidad saludable. Las categorías de genes compartidas entre ≥10 datos de GSE se indican mediante puntos negros. El histograma sobre cada gráfico indica los tiempos de las categorías de genes activados en cada categoría. b El gráfico circular mostró la representación estadística de las categorías de genes compartidas GSE. Los números enteros entre paréntesis representan categorías de genes y los paréntesis representan los recuentos de GSE compartidos. c Gráfica de puntos NES de 3 categorías de genes conservados en 10 bases de datos humanas. d Análisis de puntuación GSVA de estos 3 genes conservados en las bases de datos. e Análisis NES de 5 bases de datos de hígados de ratón. f Análisis cuantitativo de la intensidad de fluorescencia del rojo del Nilo de células L02 con sobreexpresión de 71 moléculas (n = 3 experimentos independientes). g Análisis de Western blot representativo (izquierda) y cuantificación (derecha) de los niveles de proteína LAPTM5 en hígados humanos de NASH (n = 20 personas) o del grupo sin NASH (n = 16 personas). h Tinción inmunohistoquímica de LAPTM5 en secciones de hígado de humanos en los grupos indicados (n = 5 personas/grupo). Barra de escala, 50 μm. i Análisis de correlación entre los niveles de proteína LAPTM5 (normalizados al nivel de β-actina) y NAS (r2 = 0,6964, p < 0,0001), (n = 36 personas). j Niveles de proteína LAPTM5 representativos en los hígados de ratones alimentados con dieta normal y alimentados con dieta HFHC (n = 6 ratones/grupo). Para (d), los datos se presentan como diagramas de bigotes: línea media, mediana; caja, percentil 25-75; bigote, valores mínimos a máximos; Para f, g, j, los datos se presentan como media ± SD y se utilizó la prueba t de Student de dos colas para el análisis estadístico. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Explorar más a fondo el mecanismo subyacente a la regulación negativa de la proteína LAPTM5 en NASH. Se informó que las proteínas intracelulares podrían degradarse a través del sistema ubiquitina-proteasoma o la vía de la autofagia24, los inhibidores de las diferentes vías se trataron en hepatocitos estimulados con ácido palmítico (PA), y la degradación de la proteína LAPTM5 fue rescatada por el inhibidor del proteasoma MG132 , mientras que el inhibidor de lisosomas Chlq no desempeñó un papel en el rescate. (Fig. 2a, b). Luego, las proteínas que podrían participar en la degradación de LAPTM5 se detectaron mediante espectrometría de masas IP y se encontró que NEDD4L, NEDD4, WWP2 e ITCH se ajustaban a la factura (Fig. 2c). El resultado de la espectrometría de masas se verificó mediante la prueba CO-IP y NEDD4L mostró la interacción más fuerte con LAPTM5 (Fig. 2d). Mientras tanto, la sobreexpresión de NEDD4L tuvo el efecto de promoción más fuerte en la degradación de LAPTM5 (Fig. 2e), lo que sugiere que NEDD4L es un regulador importante en la degradación de la proteína LAPTM5. Luego, la interacción entre LAPTM5 y NEDD4L se confirmó aún más in vitro mediante ensayos de precipitación CO-IP y GST (Fig. 2f, g). Para comprender mejor el mecanismo de NEDD4L que media en la degradación de LAPTM5, se realizaron ensayos IP para examinar la ubiquitinación de LAPTM5. Si bien la ubiquitinación de LAPTM5 mejoró significativamente cuando se sobreexpresó NEDD4L, y esta modificación se bloqueó después de la inactivación de NEDD4L (Fig. 2h, i). Nuestros resultados indicaron que la degradación de LAPTM5 estuvo mediada por NEDD4L a través de la ubiquitinación vinculada a K48 (Fig. 2j, k). Además, demostramos que la degradación fue promovida por la ligasa E3 de NEDD4L (Fig. 2l). Y además, la caída de NEDD4L rescató con éxito la degradación de LAPTM5 (Fig. 2m). Además, encontramos que los niveles de proteína de NEDD4L estaban significativamente regulados al alza en el grupo de NASH en comparación con el grupo de control, lo que se verificó en los sujetos humanos con NASH, los modelos de NASH de ratón y los hepatocitos estimulados con PA (Fig. 2a-e complementaria) . Los resultados demostraron que NEDD4L también estaba regulado por NASH.

ayb Imágenes de transferencia Western de los niveles de proteína LAPTM5 en hepatocitos de ratón (a) y hepatocitos L02 (b) tratados con MG132 (50 μM), Chlq (50 μM) o DMSO. c Procedimiento de identificación de las ligasas de ubiquitina E3 que interactúan con LAPTM5 mediante el análisis de IP-MS. d Interacción entre LAPTM5 y NEDD4L, NEDD4, ITCH, WWP2 en células L02. El Western blot muestra la expresión de LAPTM5 después de la transfección con los plásmidos indicados. f y g Co-IP (f) y GST desplegable (g) muestran la interacción entre LAPTM5 y NEDD4L. h Los resultados de Co-IP muestran el efecto de NEDD4L en la ubiquitinación de LAPTM5 después del tratamiento con MG132 (25 μM). i Ensayos Co-IP de la ubiquitinación de LAPTM5 después de diferentes tratamientos. j Cribado de ubiquitina de LAPTM5 por NEDD4L con los tipos indicados de ubiquitina. ( k ) Ubiquitinación de LAPTM5 en hepatocitos L02 transfectados con los plásmidos indicados. l Niveles de proteína LAPTM5 en células L02 transfectadas con los plásmidos indicados. m Resultados de Western blot de los cambios en la expresión de LAPTM5 después de la eliminación de NEDD4L en hepatocitos primarios. Las inmunotransferencias son representativas de tres experimentos independientes. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Para investigar el efecto de LAPTM5 en el metabolismo de los lípidos y la inflamación en los hepatocitos, aislamos hepatocitos primarios de ratones knockout para Laptm5 (Laptm5-KO) y ratones de control Laptm5-Flox, con hepatocitos primarios infectados con un vector de adenovirus mediado por plásmido que sobreexpresa Laptm5 (AdLaptm5 -Bandera) (Fig. 3a y Fig. 3a complementaria). La tinción con rojo Nilo (Fig. 3b y Fig. 3b complementaria) reveló que la acumulación de lípidos en los hepatocitos inducida por PAOA en el grupo Laptm5-KO se deterioró notablemente en comparación con el grupo de control y estuvo acompañada de concentraciones elevadas de triglicéridos (TG) y colesterol total (TC) (Fig. 3b, c). Por el contrario, la sobreexpresión de Laptm5 en los hepatocitos mejoró la deposición de lípidos inducida por PAOA (Figuras complementarias 3b, c). Y no se observaron diferencias significativas en la deposición de lípidos de los hepatocitos en los grupos tratados con BSA. Además, los efectos inhibitorios de LAPTM5 sobre el metabolismo de los lípidos y la inflamación se confirmaron aún más mediante qPCR y transferencia Western (Fig. 3d-g y Fig. 3d-g complementaria). Además, sobre la base de nuestros datos de RNA-seq, el análisis de agrupamiento jerárquico clasificó claramente las muestras tratadas con PAOA en dos subgrupos: Laptm5-Flox-PAOA y Laptm5-KO-PAOA (Fig. 3h). Vale la pena señalar que la eliminación de Laptm5 indujo los procesos biológicos que están relacionados con el metabolismo de los lípidos y la inflamación (Fig. 3i-k). En general, esta evidencia in vitro sugiere que LAPTM5 ejerce un efecto protector sobre la acumulación de lípidos inducida por el estrés metabólico y la inflamación en los hepatocitos.

Niveles de proteína LAPTM5 en hepatocitos aislados de ratones knockout (KO) para Laptm5 o ratones WT (n = 3 ratones/grupo). b y c Tinción con rojo Nilo (b) y contenido de TG y TC (c) en hepatocitos primarios después de las estimulaciones indicadas. Barra de escala, 25 μm, (n = 3 experimentos independientes). dye Niveles relativos de ARNm (n = 4 ratones/grupo) (d) y proteína (n = 3 ratones/grupo) (e) de marcadores relacionados con el metabolismo de ácidos grasos en los grupos indicados. fyg Niveles relativos de ARNm (n = 4 ratones/grupo) (f) y proteína (n = 3 ratones/grupo) (g) de marcadores relacionados con la inflamación en los grupos indicados. La expresión de proteínas se normalizó a β-ACTINA. h Análisis de agrupamiento jerárquico de los datos de RNA-seq de los hepatocitos primarios estimulados con PAOA aislados de ratones WT y Laptm5-KO. (ik) El análisis de enriquecimiento de la vía GSEA y los mapas de calor muestran la activación de las vías y la expresión génica del metabolismo de los lípidos y la inflamación. PAOA, 0,5 mM/1,0 mM; PA, 0,5 mM, OA, 1,0 mM. Para todos los análisis estadísticos, los resultados se representan como media ± DE. ANOVA unidireccional de la prueba post-hoc de Bonferroni (c, d—Scd1, d—Srebf1 y f—Tnf) y la prueba post-hoc de Tamhane T2 (b, d—Fasn, b—Pparg, f—Ccl2 y f —Cxcl10) se utilizó para evaluar las diferencias. Se utilizó la prueba t de Student de dos colas para evaluar las diferencias en (g). Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Para estudiar más a fondo la influencia de LAPTM5 en la esteatohepatitis y sus complicaciones, construimos ratones knockout para Laptm5 específicos de hepatocitos (Laptm5-HKO) (Figuras complementarias 4a, b y 4a) y los criamos con comida normal (NC) o dieta HFD durante 24 semanas. Los ratones Laptm5-HKO con una dieta normal no mostraron diferencias en el peso corporal, el peso del hígado o el perfil de lípidos en comparación con los ratones Laptm5-Flox. No obstante, después de 24 semanas de la dieta HFD, los ratones Laptm5-HKO exhibieron un mayor peso del hígado, peso corporal, glucosa en sangre en ayunas y niveles de TG/TC en el hígado y el suero que el grupo de control (Fig. 4b-h). Además, estas medidas en ratones Laptm5-HKO se exacerbaron aún más en comparación con los ratones Laptm5-Flox. Además, también se observó una acumulación severa de lípidos y un hígado más grande en los ratones Laptm5-HKO alimentados con HFD (Fig. 4i, j), con una expresión de genes relacionados con la absorción de lípidos (Cd36) y la síntesis (Fasn, Scd1, Pparg y Srebf1) regulado al alza (Fig. 4k-m). Además, los hígados de los ratones Laptm5-HKO sufrieron una lesión más grave debido a la dieta HFD, como lo demuestran los niveles más altos de alanina aminotransferasa (ALT) y aspartato aminotransferasa (AST) en comparación con los controles (Fig. 4n, o). Estos hallazgos revelaron que la eliminación de Laptm5 impulsó aún más la progresión de NAFLD.

Niveles de proteína LAPTM5 en los tejidos hepáticos de ratones Laptm5-HKO y Laptm5-Flox (n = 3 ratones/grupo). b Peso corporal de los ratones Laptm5-HKO y Laptm5-Flox después del consumo de NC o HFD durante 24 semanas. c – e Glucosa en sangre en ayunas ( c ), peso del hígado ( d ) y proporciones de peso del hígado a peso corporal (LW / BW) ( e ) de ratones Laptm5-HKO y Laptm5-Flox después del consumo de NC o HFD durante 24 semanas. f – h Contenido hepático de TG (f), TC (g) y TC sérico (h) de ratones en los grupos indicados. i Imágenes macroscópicas e histológicas del hígado (izquierda, barra de escala, 1 cm), H&E (centro) y Oil Red O (derecha) (barra de escala, 100 μm) tinción de secciones de hígado de ratones en los grupos indicados (n = 6 ratones/grupo). j Análisis de puntuación NAS (izquierda) y análisis estadístico de la tinción Oil red O (derecha), (n = 6 ratones/grupo). k y l Niveles relativos de ARNm (n = 4 ratones/grupo) (k) y proteína (n = 3 ratones/grupo) (l) de marcadores relevantes en los hígados de los grupos indicados. m Tinción inmunohistoquímica de PPARγ en secciones de hígado de ratones en los grupos indicados (n = 6 ratones/grupo). Barra de escala, 50 μm. n y o Concentraciones séricas de ALT y AST en ratones en los grupos indicados. Para b – h y n, o, n = 10 ratones por grupo NC, n = 11 ratones Laptm5-Flox y n = 10 ratones Laptm5-HKO para el grupo HFD. Los datos se representan como media ± SD, ns, no significativo. Mediante ANOVA unidireccional con prueba post-hoc Tamhane T2 para (b–d, f–h, k-Scd1, k-Pparg y k-Srebf1, y n y o) y análisis post hoc de Bonferroni para (e, k -Cd36 y k-Fasn). La prueba estadística no paramétrica U de Mann-Whitney en (j—izquierda) y la prueba t de Student de dos colas en (j—derecha). Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Dado que NASH es la etapa avanzada de NAFLD, alimentamos a ratones Laptm5-Flox y Laptm5-HKO con una dieta HFHC durante 16 semanas para explorar más a fondo el papel de LAPTM5 en un modelo de NASH de ratón. Aunque no se encontraron diferencias en el peso corporal, los indicadores del metabolismo de los lípidos, como el peso del hígado y la glucosa en sangre en ayunas, y la deposición de lípidos se agravaron en el grupo HKO 8 semanas después de la alimentación con HFHC, y estos indicadores se exacerbaron aún más a las 16 semanas de alimentación con HFHC como en comparación con el grupo Flox (Fig. 5a-f y Fig. 5a-d complementaria). Al mismo tiempo, la infiltración inflamatoria y la fibrosis hepática también se deterioraron con la alimentación prolongada con HFHC (Fig. 5g-i y Fig. 5e-i complementaria). De acuerdo con los hallazgos anteriores, la deficiencia hepática de Laptm5 potenció los niveles séricos de ALT y AST (Fig. 5j). En conjunto, estos resultados demostraron que la deficiencia de Laptm5 agravó significativamente la esteatohepatitis y sus complicaciones metabólicas. Luego extrajimos el ARNm de tejidos hepáticos de ratones Laptm5-HKO y Flox inducidos por HFHC para la secuenciación y examinamos sistemáticamente el perfil de expresión génica en los dos grupos después de la eliminación de Laptm5 en NASH. Descubrimos que, en NASH, la deficiencia hepática de Laptm5 provocó la regulación positiva de una amplia gama de vías y genes que promueven el metabolismo de los lípidos, la inflamación y la fibrosis (Fig. 5k-n).

a Glucosa en sangre en ayunas de ratones Laptm5-HKO y Laptm5-Flox para consumos de NC o HFHC (n = 10 ratones/grupo). b y c Peso del hígado y LW/BW (b), y contenido hepático de TG, TC (c) de ratones Laptm5-HKO y Laptm5-Flox después de alimentación NC o HFHC durante 8 o 16 semanas (n = 10 ratones/grupo). d Tinción H&E (superior) y Oil Red O (inferior) en las secciones de hígado de ratones en los grupos indicados (n = 6 ratones/grupo). Barra de escala, 100 μm. e y f Análisis de puntuación NAS (e) y el análisis estadístico de la tinción Oil red O (f) de ratones Laptm5-HKO y Laptm5-Flox después de alimentación NC o HFHC durante 8 o 16 semanas (n = 6 ratones/grupo). g Tinción de inmunofluorescencia (g) y análisis estadístico (h, i) de CD11b (rojo) en secciones de hígado de ratones en los grupos indicados. (Núcleos, azul) (n = 4 ratones/grupo). Barra de escala, 50 μm. Tinción con PSR de secciones de hígado de ratones en los grupos indicados. (8 semanas, n = 6 ratones/grupo, 16 semanas, n = 7 ratones Laptm5-Flox yn = 5 ratones Laptm5-HKO). Barras de escala, 100 μm. j Concentraciones séricas de ALT y AST de ratones en los grupos indicados (n = 10 ratones/grupo). k Análisis de agrupamiento jerárquico de los datos de RNA-seq de los ratones alimentados con la dieta HFHC. l y m Análisis de enriquecimiento de la vía GSEA de vías relacionadas con el metabolismo de los lípidos, la inflamación, la apoptosis y la fibrosis. n Mapas de calor de los genes relacionados con el metabolismo de los lípidos, las respuestas inflamatorias y la fibrosis (rojo, regulado al alza; azul, regulado a la baja) en los grupos indicados. Los datos se representan como media ± SD. La prueba estadística no paramétrica U de Mann-Whitney se utilizó para el análisis estadístico en (c—8w, e—16w e i—16w) y la prueba t de Student de dos colas en otros paneles. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Teniendo en cuenta la heterogeneidad de NASH, luego evaluamos el papel de LAPTM5 en un modelo de NASH de ratón inducido por una dieta deficiente en metionina y colina (MCD) y descubrimos que la infiltración inflamatoria y el daño hepático eran sustancialmente más graves25. De acuerdo con los resultados del modelo NASH inducido por HFHC, la deficiencia de Laptm5 evidentemente promovió trastornos metabólicos hepáticos inducidos por la dieta MCD y lesión hepática (Fig. 6a-g complementaria). En resumen, el agotamiento de Laptm5 agrava NASH en ratones.

Para confirmar el papel de Laptm5 hepática en la patogénesis de NASH, construimos un modelo de ratones transgénicos Laptm5 (Laptm5-HTG) específicos de hepatocitos (Fig. 7a yb complementarias), con los compañeros de camada (NTG) sirviendo como controles. Los ratones HTG exhibieron un menor peso del hígado y proporciones de peso de hígado a peso corporal, pero no se observó un cambio significativo en el peso corporal en comparación con los ratones NTG 16 semanas después de la alimentación con HFHC. La glucosa en sangre más alta inducida por HFHC y el perfil de lípidos empeorado también se aliviaron con la sobreexpresión de Laptm5 (Fig. 7c-g complementaria). Además, los ratones HTG mostraron una esteatosis hepática menos grave que sus homólogos NTG (Figura complementaria 7h, i). Coincidiendo con los hallazgos antes mencionados, la sobreexpresión de Laptm5 mitigó en gran medida la inflamación, la fibrosis y la lesión hepática durante la progresión de NASH (Figura complementaria 7j-p). En conjunto, estos hallazgos demostraron que LAPTM5 protege contra la esteatohepatitis y sus complicaciones metabólicas.

Para comprender mejor el mecanismo subyacente a la protección contra NASH inducida por LAPTM5, integramos los resultados de la secuenciación de ARN y el análisis de la vía de la Enciclopedia de genes y genomas de Kyoto (KEGG) y descubrimos que la desactivación de Laptm5 alteró de manera más significativa la vía de señalización de MAPK (Fig. 6a ). La transferencia de Western confirmó que la vía de señalización de MAPK fue suprimida por la sobreexpresión de Laptm5, pero mejorada por la eliminación de Laptm5 tanto in vitro como in vivo (Fig. 6b-e). Para identificar el objetivo específico que media la supresión de la vía de señalización de MAPK, realizamos espectrometría de masas IP en hepatocitos L02 que sobreexpresan Laptm5 y descubrimos que LAPTM5 interactuaba con la pequeña proteína de unión a GTP CDC42 (Ciclo de división celular 42) (Fig. 6f) , que se ha informado como un importante activador de la vía JNK estimulada por ácidos grasos saturados en los hepatocitos26. Luego confirmamos que la sobreexpresión de CDC42 agravó significativamente la acumulación de lípidos, la respuesta inflamatoria y promovió la activación de la vía de señalización de MAPK en los hepatocitos, siendo el hallazgo consistente con los resultados informados anteriormente (Fig. 8a-e complementaria). Posteriormente, la interacción entre LAPTM5 y CDC42 se corroboró aún más mediante el ensayo CO-IP y GST (Fig. 6g, h) y, además, la interacción fue más sólida con la estimulación PA (Fig. 6i). Además, la sobreexpresión de Laptm5 inhibió la expresión de la proteína CDC42 bajo estimulación PA, pero no tuvo tal efecto en la condición BSA, y los resultados se verificaron tanto en células L02 como en hepatocitos primarios (Fig. 6j, k). Mientras que la eliminación de Laptm5 promovió la expresión de CDC42 bajo estimulación PA, que tampoco fue consistente con el resultado en la condición BSA (Fig. 6l). Luego, examinamos más a fondo los niveles de proteína de CDC42 en los tejidos hepáticos de individuos con NASH o sin NASH, y se encontró que la expresión de CDC42 estaba significativamente aumentada en el grupo con NASH, lo que sugiere que LAPTM5 y CDC42 estaban correlacionados negativamente (Fig. 6m), y existía un eje regulador de NASH entre LAPTM5 y CDC42. Para identificar la ruta específica de la degradación de la proteína CDC42 mediada por LAPTM5, las células que sobreexpresan LAPTM5 se trataron con MG132 o Chlq. Encontramos que el inhibidor lisosomal Chlq podría abolir el efecto inhibidor de LAPTM5 en CDC42 (Fig. 6n, o). Liang et al. y Guo et al. demostraron que LAPTM5 podría regular la progresión de varias enfermedades sistémicas, como tumores y VIH, al promover la degradación lisosomal de proteínas relevantes. Por lo tanto, se nos llevó a plantear la hipótesis de que la regulación negativa de CDC42 estaba mediada por la degradación lisosomal de LAPTM5. Además, la tinción de colocalización de inmunofluorescencia mostró que CDC42 se distribuyó uniformemente en el citoplasma en condiciones de BSA (Fig. 8f complementaria). Sin embargo, después del tratamiento con PA, CDC42 se movió gradualmente hacia los lisosomas y se volvió granular y finalmente se co-localizó con los lisosomas en las células que sobreexpresan LAPTM5, lo que sugiere que LAPTM5 facilitó el transporte endocítico lisosomal de CDC42 y promovió su degradación por los lisosomas (Fig. 6p).

a Resultados combinados del análisis KEGG que muestran la vía MAPK más enriquecida. b y c Imágenes de transferencia Western (b) y resultados cuantitativos (c) de los niveles de proteína fosforilada y total de p38, JNK1/2 y ERK1/2 en hígados de ratones de los grupos indicados (n = 3 ratones/grupo). Los datos representan la media ± SD, se usó la prueba t de Student de dos colas para evaluar las diferencias. d y e Imágenes de transferencia Western que muestran los niveles de proteína fosforilada y total de p38, JNK1/2 y ERK1/2 en las células del grupo indicado. f Esquema de identificación de la proteína que interactúa con LAPTM5 mediante el análisis de IP-MS. El menú desplegable g y h Co-IP (g) y GST (h) muestra la interacción entre LAPTM5 y CDC42. i Ensayos Co-IP para examinar la diferencia en la fuerza de unión entre LAPTM5 y CDC42 después de la estimulación de PA. Resultados de Western blot j y k de la expresión de CDC42 exógena (j) y endógena (k) después de la sobreexpresión de diferentes concentraciones de LAPTM5. (l) Imágenes de transferencia Western (arriba) y análisis cuantitativo (abajo) de la expresión de CDC42 en hepatocitos de ratones LAPTM5-KO después de estimulación con PA (n = 3 ratones/grupo). Los datos representan la media ± SD, y se utilizó ANOVA de una vía de la prueba post-hoc de Bonferroni para evaluar las diferencias. m Imágenes de Western blot de expresión de LAPTM5 y CDC42 en el grupo de NASH o no NASH (n = 5 personas/grupo). n Resultado de transferencia Western de la expresión exógena de CDC42 después de la sobreexpresión de LAPTM5 bajo tratamiento con Chlq o MG132. o Imágenes de Western blot de tendencia de expresión de CDC42 exógeno con sobreexpresión de LAPTM5 en un gradiente bajo el tratamiento de Chlq. p Imágenes de microscopía confocal de la colocalización de LAMP1 (verde) y CDC42 (rojo) en células L02 en los grupos indicados (Núcleos, azul). Barra de escala, 8 μm (n = 3 experimentos independientes). PAOA, 0,5 mM/1,0 mM; PA, 0,5 mM, OA, 1,0 mM. Chlq, 50 µM; MG132, 50 µM. Las inmunotransferencias son representativas de tres experimentos independientes. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

A continuación, intentamos validar la presencia del eje regulador LAPTM5-CDC42 en la progresión de NASH. Inducimos la sobreexpresión de CDC42 en hepatocitos que sobreexpresan Laptm5. Nuestros resultados mostraron que la sobreexpresión de CDC42 podría eliminar el efecto protector de LAPTM5 sobre el estrés del metabolismo de los lípidos, como el perfil de lípidos desfavorable y la vía de señalización de MAPK regulada al alza cuando se sobreexpresaba CDC42 (Fig. 7a-d). Por el contrario, la eliminación de CDC42 obstaculizó con éxito el agravamiento de la acumulación de lípidos y la inflamación en los hepatocitos cuando se eliminó Laptm5 (Fig. 7e-h). En conjunto, estos resultados indican que LAPTM5 desempeña un papel protector en la EHNA al mediar en la homeostasis proteica de CDC42.

un análisis de transferencia Western de JNK1/2 total y de fosforilación, y p38 después de sobreexpresar los plásmidos indicados en células L02. b – d Tinción con rojo Nilo (b) y contenido de TG (d) de células L02 después del tratamiento con PAOA en los grupos indicados. Barra de escala, 25 μm (n = 3 experimentos independientes). e Análisis de transferencia Western de hepatocitos primarios knockout para Laptm5 infectados con adenovirus knockdown CDC42 en los grupos indicados. f – h Tinción con rojo Nilo (f) y contenido de TG (h) de hepatocitos primarios después del tratamiento con PAOA en los grupos indicados (n = 3 experimentos independientes). PAOA, 0,5 mM/1,0 mM; PA, 0,5 mM, OA, 1,0 mM. Chlq, 50 µM; MG132, 50 µM. Los datos representan la media ± SD, se usó ANOVA unidireccional de la prueba post-hoc de Bonferroni para evaluar las diferencias en (c, d) y (g, h). Las inmunotransferencias son representativas de tres experimentos independientes. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Finalmente, examinamos el efecto terapéutico de dirigirse al eje LAPTM5-CDC42 en NASH. Se inyectó adenovirus que sobreexpresa Laptm5 (AdLAPTM5) en ratones que habían recibido una dieta HFHC durante 8 semanas. Luego, los ratones fueron alimentados con la dieta HFHC durante otras 4 semanas, se usó AdGFP como control (Fig. 8a). El análisis de transferencia Western confirmó que LAPTM5 estaba sobreexpresado y que la expresión de p-JNK1/2 y CDC42 estaba regulada negativamente en los hígados de los ratones tratados con AdLAPTM5 (Fig. 8b). En comparación con los ratones AdGFP, los ratones inyectados con AdLAPTM5 mostraron una disminución significativa de la glucosa en sangre en ayunas, el peso del hígado y la relación entre el peso del hígado y el peso corporal (Fig. 8c, d). Además, la sobreexpresión de Laptm5 mediada por adenovirus mejoró sustancialmente la acumulación de lípidos, la inflamación y la lesión hepática en los hígados de ratones alimentados con HFHC (Fig. 8e-m). Tomados en conjunto, estos hallazgos sugirieron fuertemente que LAPTM5 tiene una buena perspectiva de servir como un objetivo terapéutico para el tratamiento de NASH y trastornos metabólicos.

un esquema de construcción de modelos NASH terapéuticos mediados por AdLAPTM5 en ratones HFHC. b Representa los resultados de detección de WB de las proteínas indicadas en los grupos (n = 3 ratones/grupo). cyd Glucosa en sangre en ayunas (c), peso del hígado y LW/BW (d) de ratones en los grupos indicados (n = 10 ratones/grupo). e Contenido hepático de TG y TC de ratones en el grupo indicado (n = 10 ratones/grupo). f Tinción H&E (superior) (n = 6 ratones/grupo) y Oil Red O (inferior) (n = 5 ratones/grupo) en las secciones de hígado. Barra de escala, 100 μm. g Análisis de puntuación NAS del grupo en el panel (f) (n = 6 ratones/grupo). h Análisis estadístico de Oil red O en el grupo del panel (f) (n = 5 ratones/grupo). i Niveles relativos de ARNm de genes relacionados con el metabolismo de ácidos grasos en el hígado de ratones en los grupos indicados (n = 6 ratones/grupo). j y k Tinción de inmunofluorescencia (j) y análisis estadístico (k) de CD11b (rojo) en las secciones de hígado de ratones alimentados con HFHC en los grupos indicados (n = 5 ratones/grupo). Barra de escala, 50 μm. l Niveles relativos de ARNm de genes proinflamatorios en el hígado de ratones en los grupos indicados (n = 6 ratones/grupo). m Concentraciones séricas de ALT y AST de ratones en los grupos indicados (n = 10 ratones/grupo). Los datos se representan como media ± SD, se usó la prueba t de Student de dos colas para evaluar las diferencias en todos los paneles. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Nuestros resultados demostraron que LAPTM5 podría ser degradado por ubiquitinación por NEDD4L bajo estrés metabólico. La sobreexpresión de LAPTM5 atenuó la esteatosis hepática, la respuesta inflamatoria y la fibrosis. De manera mecánica, LAPTM5 puede unirse directamente a CDC42, promover su degradación lisosomal y luego inhibir la activación de la vía de señalización de la quinasa terminal NH2 de c-Jun, cumpliendo así su función. El hepatocito LAPTM5 es un objetivo terapéutico prometedor para NASH.

LAPTM5 es una proteína transmembrana de expansión múltiple que contiene un motivo de interacción con ubiquitina (UIM) y tres motivos PY que se unen a los dominios Nedd4-WW. Al mismo tiempo, el complejo NEDD4-LAPTM5 recluta la unión de GGA3 ubiquitinada a LAPTM5-UIM27. Un estudio anterior informó que la ubiquitina ligasa E3 ITCH se une y regula negativamente a LAPTM5 a través de la vía de ubiquitinación28. Nuestro estudio mostró que LAPTM5 se redujo significativamente en los modelos NASH, y su regulación a la baja se realizó a través de la vía de la ubiquitina-proteasoma. Luego encontramos que las ligasas de ubiquitina NEDD4L y E3 interactuaban con LAPTM5 y promovían la ubiquitinación de LAPTM5 ligada a K48. En consecuencia, apuntar al bucle de regulación fisiológica de NEDD4L-LAPTM5 podría ser una estrategia eficaz para tratar la EHNA.

Los mecanismos moleculares que subyacen a la patogénesis de NASH son multifactoriales e intrincados29, múltiples estudios han demostrado que la vía de señalización de MAPK está involucrada en el desarrollo y progresión de NASH. Una dieta rica en grasas podría activar la expresión de JNK en el hígado30. En modelos celulares de NASH, el ácido graso saturado (ácido palmítico) activó PPARα, lo que provocó disfunción mitocondrial dependiente de c-JNK y muerte de hepatocitos31. La vía de señalización de P38 desempeña un papel importante en la respuesta celular provocada por la inflamación y la apoptosis celular inducida por el estrés32. Glowacka et al. y Chen et al. demostró que LAPTM5 jugó un papel importante en la modulación y activación de la vía de señalización de MAPK15,33. En este estudio, el análisis bioinformático, en combinación con el estudio molecular, mostró que la sobreexpresión de LAPTM5 inhibió la activación de JNK1/2 y p38, pero la deleción de LAPTM5 la intensificó en modelos NASH.

Además, estudios recientes documentaron que las pequeñas proteínas de unión a GTP CDC42 desempeñan un papel importante en la patogenia de la NASH al modular la activación de la vía de señalización MAPK34. La activación de CDC42 es necesaria para la activación de JNK dependiente de MLK3 estimulada por SFA en los hepatocitos, y la disminución de la expresión de CDC42 puede mitigar la activación de JNK26. De acuerdo con estos hallazgos, nuestro estudio encontró que LAPTM5 interactuaba con CDC42 y regulaba su expresión. Además, la sobreexpresión de CDC42 anuló el efecto protector de LAPTM5 sobre el metabolismo de los lípidos. LAPTM5 moduló principalmente la progresión de NASH al regular la expresión de CDC42 y la activación de la vía de señalización de MAPK.

La interacción entre LAPTM5 y CDC42 aún no se ha dilucidado. LAPTM5 se localiza en la membrana lisosomal y participa en una amplia gama de procesos patológicos y fisiológicos. Kawai et al. informó que LAPTM5 promovió la translocación lisosomal y la degradación de CD3ζ14. Ouchida et al. demostraron que LAPTM5 interactuaba con BCR y promovía su degradación lisosomal en células B de ratón35. Mientras tanto, varios estudios recientes demostraron que LAPTM5 podría regular la progresión de algunas afecciones sistémicas, como las neoplasias malignas y el VIH, al promover la degradación lisosomal de proteínas relevantes36,37. Además, la vía de degradación lisosomal también juega un papel importante en la progresión de NASH. Estudios anteriores han demostrado que TMBIM1 promueve la degradación lisosomal de TLR4 e inhibe la resistencia a la insulina, la esteatosis hepática y la inflamación inducidas por una dieta rica en grasas38. En el presente estudio, encontramos que LAPTM5 podría promover la localización y degradación lisosomal de CDC42 bajo la estimulación de PA. Sin embargo, la expresión y localización de CDC42 no se vieron afectadas por la condición de BSA. Esto indica que la correlación entre LAPTM5 y CDC42 puede haber cambiado después del tratamiento de PA. Por ejemplo, puede haber algunos cambios en los dominios proteicos y la actividad molecular de LAPTM5 y CDC42 después de la estimulación con PA. Youngshil et al. informaron que las funciones de clasificación y tráfico de proteínas de LAPTM5 estaban estrictamente reguladas por diferentes dominios de la misma27. Manju et al. informaron que la activación de CDC42 juega un papel clave en la regulación de la progresión de la enfermedad, y la intensidad de la actividad de CDC42 también afecta la función biológica de la misma26. Por lo tanto, después de la estimulación con PA, pueden haber ocurrido cambios delicados y complejos dentro de las células. Y estos mecanismos profundamente arraigados requieren más estudio.

En resumen, en este estudio, identificamos a LAPTM5 como un supresor no informado de NASH que podría regular negativamente la vía p38/c-JNK al promover la degradación del lisosoma CDC42 en los hepatocitos. Nuestro estudio mostró que la terapia con Laptm5 mediada por adenovirus fue eficaz contra NASH y que la expresión de la proteína LAPTM5 se correlacionó con la progresión clínica de NASH. Estos hallazgos indican que dirigirse a Laptm5 específico de hepatocitos puede ser una alternativa terapéutica eficaz para tratar NASH y merece más investigación preclínica.

Quedan por responder algunas preguntas sobre el papel de LAPTM5 en el tratamiento de NASH. Por ejemplo, ¿cómo transporta LAPTM5 CDC42 al lisosoma para su degradación proteica y, específicamente, cómo transcurre el proceso? ¿Cómo regula CDC42 la actividad de las vías posteriores de p38 y JNK1/2? Todos estos temas merecen una mayor exploración. Además, la correlación entre LAPTM5 y NASH aún debe verificarse mediante ensayos clínicos a gran escala. Nuestro experimento se realizó en ratones y se necesitan estudios que involucren modelos NASH de animales más grandes, como primates, antes de pasar a los ensayos clínicos.

Los reactivos, anticuerpos y cebadores clave utilizados en este estudio se enumeran en Materiales complementarios.

Todos los experimentos relacionados con el cuidado de los animales descritos en este estudio se realizaron de acuerdo con las Directrices para el cuidado y uso de animales de laboratorio redactadas por los Institutos Nacionales de Salud de EE. UU. (NIH Publication, 8th Edition, 2011). Los Comités Institucionales de Cuidado y Uso de Animales de la Facultad de Medicina de Tongji y la Universidad de Ciencia y Tecnología de Huazhong aprobaron los protocolos con animales utilizados en este estudio.

Se alojaron ratones macho C57BL/6 adultos de 8 a 10 semanas de edad que pesaban 22 a 30 g, en condiciones libres de patógenos en un ambiente con temperatura controlada a 22–24 °C, ambiente con humedad controlada al 40–70 % bajo un Ciclo de luz/oscuridad de 12 h con acceso ad libitum a agua y comida. Los ratones gozaban generalmente de buena salud antes de HFD (Proteína, 20 %; grasa, 60 %; carbohidratos, 20 %; H10060, Beijing HUAFUKANG Bioscience Co., Ltd) durante 24 semanas para establecer un modelo de hígado graso, HFHC (42 % de grasa, 44 % de carbohidratos, 14 % de proteínas y 0,2 % de colesterol; dieta TP26304; Trophic Diets, Nantong, China) durante 16 semanas, dieta MCD (TP3005G; Trophic Diets, Nantong, China) durante 4 semanas para establecer el modelo NASH o NCD ( proteínas, 18 %; grasas, 4 %; carbohidratos, 78 %; 1010001, Jiangsuxietong, China) y MCS (TP3005GS; Trophic Diets, Nantong, China). La dislocación cervical se utilizó para la eutanasia de ratones. Todos los animales fueron alimentados y criados en la División de Recursos de Animales de Laboratorio de la Facultad de Medicina de Tongji.

La recolección y aplicación de muestras humanas se llevó a cabo bajo la supervisión del comité de ética del Hospital Renmin de la Universidad de Wuhan con el número de ética WDRY2018-K001 y cumplió con los principios de la Declaración de Helsinki. Todos los individuos han firmado un consentimiento informado para el uso de muestras clínicas en el presente estudio.

Obtuvimos muestras de hígado esteatósico humano de pacientes con esteatosis simple o EHNA que se habían sometido a biopsia hepática o trasplante de hígado. Las muestras de hígado no esteatósico se obtuvieron de las regiones sanas de los hígados de donantes que se habían sometido a resección hepática debido a quistes hepáticos o hemangioma hepático. Las personas inscritas en este estudio fueron excluidas de la infección por el virus de la hepatitis, el abuso de drogas o el consumo excesivo de alcohol (>140 g para hombres o >70 g para mujeres, por semana). Las muestras de hígado de los pacientes se obtienen del grupo sin NASH de 16 personas y del grupo con NASH de 20 personas. Para el grupo sin EHNA, hay 9 pacientes mujeres y 7 pacientes hombres con rangos de edad de 27 a 67 años. Para el grupo NASH, hay 13 pacientes mujeres y 7 pacientes hombres con edades que oscilan entre los 19 y los 40 años.

Los ratones Laptm5-flox se generaron usando el sistema CRISPR/Cas9 en el fondo C57BL/6. Se diseñaron dos ARN de guía única (sgRNA) (enumerados en la Tabla S1) dirigidos a los intrones Laptm5 1 y 2 utilizando una herramienta de diseño CRISPR en línea (http://chopchop.cbu.uib.no/). Los vectores de expresión de sgRNA se construyeron utilizando un esqueleto de pUC57-sgRNA (Addgene, 51132). También diseñamos un vector donante que incluía dos brazos homólogos, una región de codificación media (CDS) y dos secuencias loxP en la misma dirección para la reparación de recombinación homóloga. A continuación, los vectores de expresión sgRNA y Cas9 (Addgene, 44758) se transcribieron in vitro, y la mezcla de mRNA obtenidos in vitro con el vector donante se inyectó en los cigotos de ratones mediante un aparato de microinyección. A continuación, los cigotos inyectados se trasplantaron al útero de los ratones receptores y se obtuvieron ratones Laptm5-flox mediante genotipificación. Posteriormente, los ratones fundadores se aparearon con ratones C57BL/6 hasta que se obtuvieron ratones Laptm5-flox/flox y se aparearon con ratones transgénicos Alb-Cre específicos de hígado (JAX, 003574). Se seleccionaron ratones Laptm5-flox/flox/Alb Cre (Laptm5-HepKO). Los cebadores de identificación utilizados se enumeran en las Tablas P1–P5.

La región CDS de Laptm5 se amplificó a partir de ADNc de ratón obtenido mediante transcripción inversa para construir el vector de sobreexpresión de pALB. Los plásmidos secuenciados correctamente se linealizaron mediante la endonucleasa de restricción PvuI; los fragmentos recuperados fueron purificados y utilizados para microinyección, posteriormente se obtuvieron e identificaron ratones de generación F0. Los primeros ratones positivos se aparearon con el tipo salvaje, y los ratones positivos de la generación F1 se seleccionaron para el apareamiento para obtener una cepa de ratón transgénico Laptm5 específica para el hígado genéticamente estable. Los cebadores utilizados se enumeran en la Tabla S3.

Se aislaron hepatocitos primarios de ratones C57BL/6 macho de 6 a 8 semanas de edad. Brevemente, los ratones fueron anestesiados y luego se abrió la cavidad abdominal. La vena cava hepática inferior se perfundió con solución de lavado hasta que el hígado se volvió amarillo. Finalmente, la solución de lavado que contenía colagenasa IV al 0,05% se usó para digerir el hígado. Luego se extrajo el hígado y se abrió la cápsula hepática con micropinzas. A continuación, los tejidos se filtraron a través de un filtro celular de 100 μm para obtener hepatocitos primarios, que luego se centrifugaron a 50 × g durante 3 min y se purificaron en una solución de Percoll al 50%. Los hepatocitos primarios purificados se cultivaron en DMEM que contenía suero bovino fetal al 10 % y penicilina-estreptomicina al 1 % en una incubadora saturada de dióxido de carbono/agua al 5 % a 37 °C.

El hepatocito humano L02, el riñón embrionario humano 293 y las líneas celulares 293T se adquirieron de la Colección de Cultivos Tipo de la Academia China de Ciencias (Shanghai, China). Todas las líneas celulares se examinaron en busca de contaminación por micoplasma y los resultados fueron negativos. Las células se cultivaron en DMEM que contenía suero bovino fetal al 10 % y penicilina-estreptomicina al 1 % en una incubadora saturada de dióxido de carbono/agua al 5 % a 37 °C. Antes de los experimentos, todas las líneas celulares se verificaron a través de perfiles de ADN repetidos en tándem cortos. Todas las líneas celulares de nuestro laboratorio se sometieron a pases no más de 30 veces después de la reanimación y se analizaron de forma rutinaria para detectar contaminación por micoplasma mediante PCR. Para establecer un modelo de esteatosis hepática in vitro, se estimularon hepatocitos primarios de ratón y células L02 con ácido palmítico (PA; 0,5 mM; P0500; Sigma-Aldrich; St. Louis, MO, EE. UU.) y ácido oleico (OA; 1,0 mM; O -1008; Sigma-Aldrich; St. Louis, MO, EE. UU.) (disuelto en BSA libre de ácidos grasos al 0,5 %) a las concentraciones indicadas durante 12–24 h. Para el grupo de control, las células se estimularon con BSA libre de ácidos grasos (0,5 %; BAH66-0100; Equitech Bio, Kerrville, TX, EE. UU.). Para determinar si LAPTM5 facilita la degradación proteasomal de CDC42, las células se trataron con 50 μmol/L de Chlq (S6999; Selleck Chemicals) durante 12 h.

Los niveles de glucosa en sangre en ayunas y los niveles de peso corporal de los ratones se evaluaron cada 4 semanas, y los niveles de glucosa en sangre en ayunas se midieron con un glucómetro (Life Scan, Milpitas, CA, EE. UU.). Las concentraciones séricas de TC, ALT y AST se midieron utilizando un analizador de sistema químico ADVIA 2400 (Siemens, Tarrytown, NY, EE. UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Los contenidos de TG y TC (290-63701 para TG, 294-65801 para TC; Wako; Tokio, Japón) de hepatocitos primarios, células L02 y tejidos hepáticos se midieron usando kits comerciales de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Los tejidos hepáticos de los ratones se fijaron con formaldehído al 10 % durante 48 horas y, posteriormente, el bloque de tejido se recortó e incrustó mediante deshidratación del tejido. Las secciones de hígado incluidas en OCT se tiñeron con Oil Red O (O0625; Sigma-Aldrich; St. Louis, MO, EE. UU.), y las secciones de hígado incluidas en parafina se tiñeron con H&E (Hematoxylin, G1004, Servicebio, Wuhan, China; Eosin , BA-4024, Baso, Zhuhai, China) y picrosirius red (PSR; 26357-02; Hede biotechnology; Beijing, China), que se utilizaron para las pruebas de fibrosis hepática. Todas las imágenes histológicas se adquirieron a través de un microscopio óptico (ECLIPSE 80i; Nikon, Tokio, Japón).

La inmunohistoquímica para analizar PPARγ y la expresión de CD11b se realizó en secciones de hígado incluidas en parafina (5 μm) utilizando PPARγ (dilución 1:400, 2435T, tecnología de señalización celular), CD11b (dilución 1:4000, BM3925, Boster; Wuhan, China) y anticuerpos LAPTM5 (dilución 1:200, sc134676, Santa Cruz). Para la recuperación de antígenos, las muestras se calentaron en una olla a presión durante 5 minutos en una solución de recuperación de antígenos tisulares con citrato de pH_6,0. Después de enfriar, las muestras se colocaron en H2O2 al 3 % durante 20 min para extinguir la actividad del peróxido endógeno. A continuación, los portaobjetos se bloquearon con BSA al 10 % durante 30 min después de lavarlos con PBS. Posteriormente, las secciones se incubaron con anticuerpos primarios durante la noche a 4 °C, después de lavar con PBS tres veces (5 min/lavado), incubando las secciones con Rabbit Two-step Detection Kit (PV-9001, ZSGB-BIO; Beijing, China) de acuerdo con el protocolo del fabricante. La tinción inmunohistoquímica se visualizó utilizando un kit de sustrato de 3,3′-diaminobencidina (DAB) (ZLI-9018; ZSGB-BIO, Beijing, China) y contratinción con hematoxilina. Las imágenes se capturaron con un microscopio óptico (ECLIPSE 80i; Nikon, Tokio, Japón).

Para realizar la tinción de inmunofluorescencia de CD11b, después de la recuperación del antígeno, las secciones de tejido hepático en parafina se marcaron primero con un anticuerpo primario anti-CD11b (dilución 1:800, BM3925, Boster; Wuhan, China) a 4 °C durante la noche y luego se incubaron con un fluoróforo. -anticuerpo secundario conjugado [Alexa Fluor 568 cabra anti-conejo IgG (H + L); A11036; Invitrogen; Carlsbad, CA, EE. UU.] a 37 °C durante 1 h. Las imágenes de inmunofluorescencia se adquirieron a través del microscopio de fluorescencia (BX51; Olympus, Tokio, Japón).

Las células L02 y los hepatocitos primarios de ratón se trataron con PAOA durante 0, 12 o 24 h. Posteriormente, las células se fijaron con paraformaldehído al 4 % durante 15 min y se tiñeron con Nile Red (1 mM en PBS; 22190; Fanbo Biochemicals; Beijing, China). La acumulación de lípidos se visualizó y cuantificó mediante microscopía confocal de barrido láser (TCS SP8; Leica, Wetzlar, Alemania) o un sistema de análisis de alto contenido (Operetta CLS, Waltham, MA, EE. UU.).

Para la tinción del cubreobjetos, los hepatocitos L02 transfectados con plásmidos relacionados se incubaron con anticuerpos anti-LAMP1 de ratón y anti-CDC42 de conejo a 37 °C durante 2 h y posteriormente se marcaron con anticuerpos secundarios conjugados con fluoróforo. Los núcleos de todas las imágenes se tiñeron con DAPI (S36939; Invitrogen; Carlsbad, CA, EE. UU.) y las imágenes se adquirieron con un microscopio de barrido láser confocal (TCS SP8; Leica; Wetzler, Alemania). Antes de la carga de colorante, las células se trataron con PA (0,5 mM) en presencia de Chlq (50 μM) durante 12 h.

Los productos de PCR de proteínas transmembrana lisosomales se obtuvieron de bibliotecas de ADNc y se clonaron en los vectores correspondientes para obtener plásmidos sobreexpresados. Se subclonaron secuencias completas de las regiones codificantes humanas LAPTM5, NEDD4, WWP2, ITCH y CDC42 en vectores pcDNA5-HA, pcDNA5-Flag, pcDNA5-Myc y pcDNA5-GST-HA para generar Flag-LAPTM5, HA-NEDD4, HA -WWP2, HA-ITCH, Myc-CDC42, GST-HA-LAPTM5 y GST-HA-CDC42 plásmidos recombinantes respectivamente. De manera similar, las secuencias completas de NEDD4L humano se insertaron en el vector pcDNA3.1-HA para generar HA-NEDD4L y luego se amplificó HA-NEDD4L (C943S). El sistema de paquete de lentivirus comprendía dos plásmidos de empaquetamiento, pMD2.G y psPAX2, y un plásmido de fago-Flag-LAPTM5 objetivo. Se mezclaron y ensamblaron para infectar células T HEK 293. Después de 48 h de infección, se recolectó el sobrenadante de células T HEK 293 para infectar células L02 con polibreno (8 μM; H9268; Sigma, St. Louis, MO, EE. UU.) para ayudar a la transfección. Se usó puromicina (A1113803; Gibco, Grand Island, NY, EE. UU.) para generar líneas celulares estables con sobreexpresión de LAPTM5, y se usó proteína fluorescente verde lentiviral (lenti-GFP) como control.

El plásmido lanzadera pENTR-U6-CMV-flag-T2A-EGFP y el sistema de expresión adenoviral ViraPower (V493-20; Invitrogen; Carlsbad, CA, EE. UU.) se utilizaron para generar vectores adenovirales que sobreexpresan LAPTM5 de ratón. Después de la linealización con Pacl (R0547L; NEB, MA, EE. UU.), los vectores adenovirales se transfectaron en 293 células utilizando el reactivo de transfección de polietilenimina (24765-1; Polysciences, Warrington, Reino Unido). Las células se recolectaron después de 6 a 7 días para obtener el adenovirus inicial. Después de tres generaciones de amplificación, el adenovirus LAPTM5 se purificó mediante centrifugación en gradiente de densidad con cloruro de cesio, y el título se midió utilizando el método de dosis infectiva de cultivo tisular al 50 % (TCID50). Los hepatocitos primarios de ratón se infectaron con adenovirus a una multiplicidad de infección (MOI) de 50. Para los ensayos in vivo, se inyectó intraperitonealmente adenovirus que expresaba proteína LAPTM5 de ratón o GFP (adquirido de HANBIO; Shanghái, China) 8 semanas después del consumo de HFHC.

La proteína total se aisló y lisó de tejidos o células animales mediante tampón de lisis RIPA, y las proteínas se cuantificaron utilizando el kit de ensayo de proteínas Pierce BCA (23225, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.). Se cargaron cantidades iguales de las proteínas indicadas en un gel SDS-PAGE al 10 % y se transfirieron a membranas de PVDF. Posteriormente, las membranas de PVDF se bloquearon con leche descremada al 5 % disuelta en TBST y se incubaron con los anticuerpos primarios correspondientes durante la noche a 4 °C, seguidos de anticuerpos secundarios conjugados con HRP durante 1 hora. Luego, las proteínas se detectaron con un kit ECL y se visualizaron con el sistema de imágenes ChemiDoc XRS+.

El ARNm total se extrajo de tejidos animales y células cultivadas usando TRIzol, y el ADNc se preparó usando los reactivos de transcripción inversa de Vazyme. qPCR se realizó utilizando SYBR Green de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los niveles de expresión de ARNm de los genes relacionados se normalizaron a los del gen de limpieza β-actina.

Se realizó inmunoprecipitación (IP) para detectar las interacciones entre proteínas. Brevemente, se cotransfectaron células HEK293T o L02 con los plásmidos indicados. Después de la transfección durante aproximadamente 16 a 24 h, las células se lisaron con tampón de lisis IP 150 mM enfriado con hielo (Tris-HCl 20 mM, pH 7,4; NaCl 150 mM; EDTA 1 mM y NP-40 al 1 %) que contenía un inhibidor de la proteasa cóctel (04693132001; Roche; Basilea, BS, Suiza). Después de la centrifugación (12 000 × g durante 10 min), el sobrenadante se recogió en un tubo EP nuevo. Posteriormente, cada muestra se incubó con perlas de agarosa de proteína A/G (AA104307; Bestchrom; Shanghái, China) durante 1 h y luego con los anticuerpos indicados a 4 °C durante la noche. Después de la centrifugación (3500 xg durante 5 min), las perlas se lavaron tres veces con tampón de lisis IP 300 mM y dos veces con tampón de lisis IP 150 mM. Finalmente, las perlas se calentaron a 95 °C en tampón de carga SDS durante 15 min y se separaron mediante SDS-PAGE para transferencia Western.

Las células L02 cotransfectadas con los plásmidos indicados se lisaron en 80 μl de tampón de lisis IP 150 mM y 10 μl de tampón de lisis SDS al 10 % y luego se desnaturalizaron calentando a 95 °C durante 15 min. Después de calentar, se añadieron a los lisados ​​900 μl de tampón de lisis IP 150 mM que contenía un cóctel de inhibidores de proteasa. Después de la sonicación y la centrifugación (12 000 × g durante 15 min), el sobrenadante se recogió y se incubó con los anticuerpos indicados y perlas de agarosa con proteína A/G durante 3 h a 4 °C. Las perlas se retiraron después de la centrifugación (3500 × g durante 5 min) y se lavaron con tampón de lisis IP 500 mM (Tris-HCl 20 mM, pH 7,4; NaCl 500 mM; EDTA 1 mM y NP-40 al 1%) tres veces. Luego, las perlas se calentaron a 95 ° C con tampón de carga SDS durante 15 min y se separaron mediante SDS-PAGE para transferencia Western como se describió anteriormente.

Para el análisis de la expresión génica diferencial entre los diferentes grupos, se extrajo el ARNm total y se construyeron bibliotecas de ADNc mediante transcripción inversa. Las bibliotecas de un solo extremo se secuenciaron utilizando un BGISEQ 500 (MGI Tech; Shenzhen, China). Las lecturas se asignaron a genomas de referencia de ratón Ensembl (mm10/GRCm38)/humano (hg38/GRCh38) utilizando el software HISAT2 (versión 2.1.0). Los archivos Binary Alignment Map (BAM) se generaron a través de SAMtools (versión 1.4), y los valores de genes de fragmentos por kilobase del modelo de exón por millón de fragmentos mapeados (FPKM) se calcularon utilizando StringTie (versión 1.3.3b); DESeq2 (versión 1.2.10) se utilizó para el análisis de expresión génica diferencial. Los genes con un cambio de pliegue > 1,5 y los valores de P ajustados correspondientes <0,05 se identificaron como DEG.

Usamos el algoritmo de distancia promedio no ponderado para generar un árbol de agrupamiento para el análisis de agrupamiento jerárquico. Los niveles de expresión génica de cada réplica biológica se normalizaron utilizando el método de puntuación z.

Cada vía KEGG o término de proceso biológico GO y los genes involucrados se definieron como un conjunto de genes, y se generó una lista clasificada y un tipo de permutación "'conjunto de genes'" usando la métrica "'Signal2Noise'" para implementar GSEA usando Java GSEA ( versión 3.0) plataforma.

Realizamos un análisis de enriquecimiento de la ruta KEGG utilizando la prueba exacta de Fisher con nuestro script R interno y descargamos las anotaciones de la ruta KEGG de la base de datos KEGG. Al mismo tiempo, las vías con un valor de P <0,05 se definieron como vías significativamente enriquecidas.

Describimos LAPTM5 y sus proteínas que interactúan que se inmunoprecipitaron en el ensayo IP. Las proteínas se sometieron a análisis de cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS). Los estándares para seleccionar las moléculas candidatas fueron los siguientes: (1) los candidatos deben estar presentes en el grupo tratado con PAOA pero disminuidos en el grupo tratado con BSA: (2) el número de péptidos únicos debe ser >2.

Todos los datos fueron analizados a través de los métodos estadísticos correspondientes utilizando el software SPSS 21.0. Las diferencias entre dos grupos con distribución normal se determinaron mediante la prueba t de Student. Para las comparaciones entre tres o más grupos con distribución normal, se aplicó ANOVA de una vía seguido de la prueba post hoc de Bonferroni (para datos que muestran homogeneidad de varianza) o la prueba post hoc de Tamhane T2 (para datos heteroscedásticos). Cuando los datos cumplieron con una distribución no normal, se utilizó una prueba estadística no paramétrica de Kruskal-Wallis. La significación estadística se fijó en P < 0,05. Todos los datos se presentan como valores medios ± SD, y los métodos estadísticos utilizados con los valores P correspondientes para los datos se mencionan en la leyenda de cada figura. Recopilamos datos de los estudios en animales de manera ciega y no se excluyó ningún dato del análisis estadístico final.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los datos de RNA-seq generados en este estudio se han depositado en la base de datos del Archivo de lectura de secuencias de información (SRA) del Centro Nacional de Biotecnología con el código de acceso PRJNA918313 (ID 918313 - BioProject - NCBI (nih.gov)) y PRJNA918311 (ID 918311 - BioProject - NCBI (nih.gov)). Datos procesados ​​de RNA-seq de hígados humanos de pacientes con EHNA clínica y pacientes sanos o con obesidad sana (números de acceso: GSE66676, GSE63067, GSE61260, GSE48452, GSE162694_F4, GSE162694_F3, GSE162694_F2, GSE162694_F1, GSE162694_F0, GSE130970), RNA-seq de hígado muestras de NASH de ratón (números de acceso: GSE93819, GSE57290_68W, GSE57290_38W, GSE53381, GSE51432) se recolectaron de la base de datos Gene Expression Omnibus (GEO). Todos los demás datos que respaldan los hallazgos de este estudio están disponibles en el artículo y sus archivos de información complementaria y tablas complementarias. Un resumen del informe de este artículo está disponible como un archivo de información complementaria. Los datos de origen se proporcionan con este documento.

Febbraio, MA et al. Modelos preclínicos para estudiar el HCC impulsado por NASH: ¿cuán útiles son? Metab. celular 29, 18–26 (2019).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Das, K. et al. La población no obesa en un país en desarrollo tiene una alta prevalencia de hígado graso no alcohólico y enfermedad hepática significativa. Hepatología 51, 1593–1602 (2010).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Lázaro, J. et al. El índice global de preparación y revisión de políticas de NAFLD: ¿están los países listos para abordar este desafío silencioso de salud pública? J. Hepatol. 76, 771–780 (2022).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Yu, Y., Cai, J., She, Z. y Li, H. Conocimientos sobre la epidemiología, la patogenia y la terapéutica de las enfermedades del hígado graso no alcohólico. Adv. ciencia 6, 1801585 (2019).

Artículo Google Académico

David, D., & Eapen, CE ¿Cuáles son las terapias farmacológicas actuales para la enfermedad del hígado graso no alcohólico?. J. Clin. Exp. Hepatol. 11, 232–238 (2021).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Chen, Z., Yu, Y., Cai, J. & Li, H. Objetivos moleculares emergentes para el tratamiento de la enfermedad del hígado graso no alcohólico. Tendencias Endocrinol. metab. 30, 903–914 (2019).

Artículo PubMed Google Académico

Chen, M., Cai, J., Yu, Y., She, Z. y Li, H. Enfoques actuales y emergentes para el tratamiento de la esteatohepatitis no alcohólica. Expr. gen. 19, 175–185 (2019).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Trivedi, P., Bartlett, J. & Pulinilkunnil, T. Biología y función lisosomal: visión moderna del contenedor de desechos celulares. Celdas 9, 1131 (2020).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Perera, R. & Zoncu, R. El lisosoma como eje regulador. año Rev. Célula Desv. Biol. 32, 223–253 (2016).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zhang, Z. et al. Papel de los lisosomas en actividades fisiológicas, enfermedades y terapia. J. Hematol. oncol. 14, 79 (2021).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Bonam, S., Wang, F. & Muller, S. Lysosomes como diana terapéutica. Nat. Rev. Descubrimiento de Drogas. 18, 923–948 (2019).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Adra, CN et al. LAPTM5: una nueva proteína de membrana de múltiples extensiones asociada a lisosomas expresada preferentemente en células hematopoyéticas. Genomics 35, 328–337 (1996).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Ouchida, R. et al. Una proteína lisosomal regula negativamente la expresión del receptor de antígeno de células T de superficie al promover la degradación de la cadena CD3zeta. Inmunidad 29, 33–43 (2008).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Kawai, Y. et al. LAPTM5 promueve la degradación lisosomal del CD3ζ intracelular pero no del CD3ζ de la superficie celular. inmunol. Biol celular. 92, 527–534 (2014).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Glowacka, WK, Alberts, P., Ouchida, R., Wang, JY y Rotin, D. La proteína LAPTM5 es un regulador positivo de las vías de señalización proinflamatorias en los macrófagos. J. Biol. química 287, 27691–27702 (2012).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Gao, L. et al. La proteína transmembrana 5 asociada a lisosomas funciona como un nuevo regulador negativo de la hipertrofia cardíaca patológica. Frente. Cardiovasc. Medicina. 8, 740526 (2021).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ye, P. et al. La fosfatasa 26 de doble especificidad protege contra la enfermedad del hígado graso no alcohólico en ratones a través de la supresión de la quinasa 1 activada por el factor de crecimiento transformante beta. Hepatología 69, 1946–1964 (2019).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Ye, P. et al. La fosfatasa 9 de doble especificidad protege contra la enfermedad del hígado graso no alcohólico en ratones a través de la supresión de ASK1. Hepatología 69, 76–93 (2019).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Wang, L. et al. El motivo tripartito 16 mejora la esteatohepatitis no alcohólica al promover la degradación de fosfo-TAK1. Metab. celular 33, 1372–1388.e1377 (2021).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Ganar, S. et al. La eliminación o eliminación de SAB mitocondrial hepático alivia el síndrome metabólico inducido por la dieta, la esteatohepatitis y la fibrosis hepática. Hepatología 74, 3127–3145 (2021).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Manso, AM et al. La inyección sistémica de AAV9.LAMP2B revierte la disfunción multiorgánica metabólica y fisiológica en un modelo murino de la enfermedad de Danon. ciencia Traducir Medicina. 12, eaax1744 (2020).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Sudhakar, JN et al. La interacción Lumenal Galectin-9-Lamp2 regula el lisosoma y la autofagia para prevenir la patogénesis en el intestino y el páncreas. Nat. común 11, 1–17 (2020).

Artículo Google Académico

Gu, S. et al. La regulación a la baja de LAPTM4B contribuye al deterioro del flujo autofágico a través de la activación sin oposición de la señalización de mTORC1 durante la lesión por isquemia/reperfusión miocárdica. Circ. Res. 127, e148–e165 (2020).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Nedelsky, N., Todd, P. & Taylor, J. Autofagia y el sistema ubiquitina-proteasoma: colaboradores en neuroprotección. bioquimica Biografía. Acta 1782, 691–699 (2008).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Yang, Y., Wang, P., Wang, F., Lin, H. & Huang, Y. miR-29a modula el estrés proteostático mitocondrial ligado a GSK3β/SIRT1 para mejorar la esteatohepatitis no alcohólica en ratones. En t. J. Mol. ciencia 21, 6884 (2020).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Sharma, M., Urano, F. & Jaeschke, A. Cdc42 y Rac1 son los principales contribuyentes a la vía JNK estimulada por ácidos grasos saturados en los hepatocitos. J. Hepatol. 56, 192–198 (2012).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Pak, Y., Glowacka, WK, Bruce, MC, Pham, N. & Rotin, D. El transporte de LAPTM5 a los lisosomas requiere la asociación con la ubiquitina ligasa Nedd4, pero no la ubiquitinación de LAPTM5. J. Cell Biol. 175, 631–645 (2006).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Takaya, I., Jun, I., Ken-ichi, K., Issei, I. y Johji, I. La ubiquitina ligasa de tipo HECT ITCH se dirige a la proteína transmembrana 5 multispanning asociada a los lisosomas (LAPTM5) y previene la muerte celular mediada por LAPTM5 . J. Biol. química 286, 44086–44094 (2011).

Artículo Google Académico

Caligiuri, A., Gentilini, A. & Marra, F. Molecular patogenesis of NASH. En t. J. Mol. ciencia Rev. 17, 1575 (2016).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Harmeet, M. Los ácidos grasos libres inducen la lipoapoptosis de hepatocitos dependiente de JNK. J. Biol. química 281, 12093–12101 (2006). F, BS., W, WN. y J, GG.

Artículo Google Académico

Yuren, W. Efectos hepatoespecíficos de la fructosa en la quinasa NH2-terminal c-jun: implicaciones para la resistencia a la insulina hepática. Soy. J. Physiol. Endocrinol. metab. 287, E926–E933 (2004). & J, PM.

Artículo Google Académico

G, P et al. Vías de la proteína quinasa activada por mitógenos (MAP): regulación y funciones fisiológicas. Endoc. Rev. 22, 153–183 (2001).

Google Académico

Chen, L. et al. La regulación a la baja de LAPTM5 suprime la proliferación celular y la viabilidad que induce la detención del ciclo celular en la fase G0/G1 de las células de cáncer de vejiga. En t. J. Oncol. 50, 263–271 (2017).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Cheng, TL, Symons, M. & Jou, TS Regulación de anoikis por Cdc42 y Rac1. Exp. Resolución celular 295, 497–511 (2004).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Ouchida, R., Kurosaki, T. & Wang, JY Un papel para la proteína transmembrana 5 asociada a lisosomas en la regulación negativa de los niveles de receptores de células B de superficie y la activación de células B. J. Immunol. 185, 294–301 (2010).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Jiang, B. et al. La proteína transmembrana lisosomal 5 promueve la metástasis específica de pulmón al regular la degradación lisosomal de BMPR1A. Nat. común 13, 4141 (2022).

Artículo ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zhao, L. et al. Vpr contrarresta la restricción de LAPTM5 para promover la infección por VIH-1 en los macrófagos. Nat. común 12, 3691 (2021).

Artículo ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zhao, GN et al. Tmbim1 es un regulador corporal multivesicular que protege contra la enfermedad del hígado graso no alcohólico en ratones y monos al actuar sobre la degradación lisosomal de Tlr4. Nat. Medicina. 23, 742–752 (2017).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Descargar referencias

Agradecemos al Dr. Hao Zhang (Union Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology), Shan-Shan Chen (Central Hospital of Wuhan, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology) por su asistencia técnica y aliento mental. . Este trabajo fue apoyado por subvenciones de The Fundamental Research Funds for the Central Universities (HUST No. 2021GCRC037) y la National Natural Science Foundation of China (81730015, 82170504, 81974048).

Estos autores contribuyeron igualmente: Lang Jiang, Jing Zhao, Qin Yang, Mei Li.

Departamento de Cirugía Cardiovascular, Union Hospital, Tongji Medical College, Universidad de Ciencia y Tecnología de Huazhong, 430022, Wuhan, China

Lang Jiang, Hao Liu, Xiaoyue Xiao, Peiwen Yang y Jiahong Xia

Departamento de Cardiología, Hospital Central de Wuhan, Facultad de Medicina de Tongji, Universidad de Ciencia y Tecnología de Huazhong, 430014, Wuhan, China

Jing Zhao, Manhua Chen y Ping Ye

Departamento de Cardiología, Hospital Central de Huanggang, 438021, Huanggang, China

qin-yang

Facultad de Ciencias Médicas Básicas, Universidad de Wuhan, 430071, Wuhan, China

Mei Li, Song Tian y Sha Hu

Departamento de Cardiología, Hospital Renmin de la Universidad de Wuhan, 430060, Wuhan, China

zhen liu

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

P.Ye. y JX diseñó los experimentos. LJ, JZ, QY y ML realizaron los experimentos, el análisis de datos y escribieron el manuscrito. ST, SH y ZL realizaron análisis bioinformáticos. HL, XX y P.Yang. brindó soporte técnico. MC proporcionó consejos y comentarios. P.Ye., MC y JX organizaron y supervisaron el estudio.

Correspondencia a Manhua Chen, Ping Ye o Jiahong Xia.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Communications agradece a Pablo Muriel y a los demás revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Los informes de los revisores están disponibles.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Acceso abierto Este artículo tiene una licencia internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, el intercambio, la adaptación, la distribución y la reproducción en cualquier medio o formato, siempre que se otorgue el crédito correspondiente al autor o autores originales y a la fuente. proporcionar un enlace a la licencia Creative Commons e indicar si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la regulación legal o excede el uso permitido, deberá obtener el permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Jiang, L., Zhao, J., Yang, Q. et al. La proteína transmembrana 5 asociada a lisosomas mejora la esteatohepatitis no alcohólica al promover la degradación de CDC42 en ratones. Nat Comun 14, 2654 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-37908-9

Descargar cita

Recibido: 14 Septiembre 2022

Aceptado: 05 abril 2023

Publicado: 08 mayo 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-37908-9

Cualquier persona con la que compartas el siguiente enlace podrá leer este contenido:

Lo sentimos, un enlace para compartir no está disponible actualmente para este artículo.

Proporcionado por la iniciativa de intercambio de contenido Springer Nature SharedIt

Al enviar un comentario, acepta cumplir con nuestros Términos y Pautas de la comunidad. Si encuentra algo abusivo o que no cumple con nuestros términos o pautas, márquelo como inapropiado.