Un multi comparativo

Dec 15, 2023

Scientific Reports volumen 13, Número de artículo: 9306 (2023) Citar este artículo

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Aquí, se realizó una evaluación de toxicidad comparativa de puntos de carbono precursores de residuos de café (cofCD) obtenidos utilizando principios de química verde y nanohíbridos dopados con Gd (cofNH) mediante ensayos hematológicos, bioquímicos e histopatológicos in vivo (ratones CD1, administración intraperitoneal, 14 días) y enfoque neuroquímico in vitro (terminales nerviosas de corteza de rata, sinaptosomas). Los datos de bioquímica sérica revelaron cambios similares en los grupos tratados con cofCD y cofNH, es decir, no hubo cambios en las actividades de las enzimas hepáticas y la creatinina, pero disminuyeron los valores de urea y proteína total. Los datos hematológicos demostraron aumento de linfocitos y concomitantemente disminución de granulocitos en ambos grupos, lo que podría evidenciar procesos inflamatorios en el organismo y fue confirmado por histopatología hepática; disminución de los parámetros asociados con los glóbulos rojos y el recuento de plaquetas, y aumento del volumen medio de plaquetas, lo que podría indicar problemas con la maduración de las plaquetas y se confirmó mediante histopatología del bazo. Por lo tanto, se demostró la seguridad relativa tanto de cofCD como de cofNH para el riñón, el hígado y el bazo, mientras que hubo preocupaciones sobre la maduración plaquetaria y la eritropoyesis. En un estudio de neurotoxicidad aguda, las cofCD y cofNH (0,01 mg/ml) no afectaron el nivel extracelular de L-[14C]glutamato y [3H]GABA en preparaciones de terminales nerviosas. Por lo tanto, los cofNH demostraron cambios mínimos en los ensayos bioquímicos y hematológicos del suero, no presentaron signos de neurotoxicidad aguda y pueden considerarse como agentes teragnósticos no tóxicos biocompatibles en perspectiva.

La combinación de la modalidad de imagen dentro de la entidad terapéutica es un enfoque prometedor para superar las limitaciones de los tratamientos convencionales, lo que a su vez mejora en última instancia la eficacia terapéutica. En este contexto, los nanomateriales híbridos, los nanohíbridos (NH), han atraído un interés particular en la biomedicina, debido a sus propiedades físicas y químicas distintivas1. Una imagen por resonancia magnética, MRI, es una de las técnicas de diagnóstico por bioimagen más predominantes. Entre los lantánidos, el mejor agente de contraste para el diagnóstico de IRM2 es el gadolinio (Gd) debido a su alto momento magnético y al mayor tiempo de relajación del espín electrónico3, lo que proporciona la imagen de IRM de mejor contraste. La incorporación de Gd a las nanoestructuras por un lado puede mitigar su toxicidad en el organismo, y por otro lado permite aprovechar un fenómeno de acumulación de nanopartículas en el tumor. Para superar la toxicidad, el Gd suele estar incrustado dentro de las nanovesículas (por ejemplo, liposomas y micelas), nanopartículas metálicas y nanomateriales de carbono, etc.4,5,6,7,8,9.

Entre los nanomateriales de carbono, los puntos de carbono (CD) comprenden una clase muy diversa de nanomateriales que es de especial interés debido a su bajo costo, métodos de producción simples, bajo impacto ambiental y potencial de aplicación multidisciplinaria10, 11. Una gran ventaja de la producción de CD es la posibilidad de utilizar una variedad de precursores y métodos12 y, además, se pueden obtener CD de acuerdo con los principios de la química verde. Los enfoques metodológicos de su síntesis incluyen la pirólisis asistida por microondas, métodos electroquímicos hidrotérmicos, solvotérmicos, etc.13. Además, según los principios de la química verde, los biorresiduos se utilizan ampliamente para producir CD, en particular paja de trigo14, residuos de arroz15, semillas de fenogreco16, cáscaras de frutas y verduras17,18,19,20, melaza de caña de azúcar21, residuos de café22,23,24, 25, 26, etc. Los CD poseen una composición defectuosa de sitios aromáticos y alifáticos coexistentes, cuyos componentes elementales son el grafeno, el óxido de grafeno y el diamante, cuyas proporciones y variaciones, así como la variedad de los grupos en su superficie, dependen del original. materiales y las condiciones de su síntesis.

Los CD mostraron diferente biotoxicidad en función de sus precursores y métodos de producción. En nuestro estudio anterior, se demostraron las propiedades neuroactivas de las CD obtenidas a partir de β-alanina mediante calentamiento con microondas. Estas nanopartículas (en altas concentraciones) afectaron a las características clave de la neurotransmisión inhibitoria y excitatoria, es decir, glutamato y ácido g-aminobutírico (GABA)-érgico, en terminales nerviosas aisladas de cerebro de rata27. Debe subrayarse que el glutamato y el GABA son neurotransmisores excitadores e inhibidores cruciales, respectivamente, en el sistema nervioso central, cuyo transporte y homeostasis deteriorados contribuyen a la disfunción neuronal y la patogénesis de los principales trastornos neurológicos. En otro estudio, se reveló que las CD que contienen azufre sintetizadas a partir de tiourea exhiben efectos un tercio más bajos sobre el transporte de glutamato y GABA en las terminales nerviosas en comparación con las que no contienen azufre28.

Los datos de la literatura mostraron que los CD sintetizados a partir de productos químicos sintéticos comerciales se pueden dopar con Gd utilizando un tratamiento hidrotérmico energéticamente desfavorable29,30,31,32 y un método asistido por microondas adoptado33. Faltan datos sobre la toxicidad de las nanopartículas de carbono dopadas con Gd. En particular, la toxicidad potencial de las CD dopadas con Gd (Gd-CD) sintetizadas a través de una técnica sin solvente de un solo paso con Gd-DTPA y L-arginina se evaluó mediante análisis bioquímicos séricos. Las Gd-CD demostraron una baja toxicidad para los animales en una aplicación a largo plazo34. En otro estudio, las CD de Gd se prepararon mediante un método hidrotermal con ácido 3,4-dihidroxihidrocinámico, 2,2′-(etilendioxi)bis(etilamina) y cloruro de gadolinio. El ensayo de hemólisis de Gd-CD no mostró un fenómeno de hemólisis significativo, lo que indica un pequeño daño a los glóbulos rojos y biocompatibilidad con la sangre. En un estudio de citotoxicidad con células de riñón embrionario humano (293 células T, ensayo CCK-8), la viabilidad celular no cambió con Gd-CD, lo que indicó su baja citotoxicidad in vitro. Los datos histopatológicos de los tejidos de los ratones tratados no mostraron anomalías o lesiones aparentes en el corazón, los riñones, el hígado y el bazo, en comparación con los grupos de control. Se concluyó que las Gd-CD presentaban una buena biocompatibilidad y eran adecuadas para una mayor bioaplicación31. Además, se utilizó Gd meglumina junto con ácido cítrico y dietilentriamina para sintetizar Gd-CD mediante un método hidrotermal de un solo paso y las nanopartículas demostraron una citotoxicidad discreta32. Los Gd-CD conjugados con aptámeros AS1411 se prepararon mediante un sencillo enfoque solvotérmico. No hubo daño evidente en las células 4T1 en comparación con el grupo de control en el ensayo in vitro, no se observó hemólisis evidente después de la aplicación de nanopartículas in vivo y las nanopartículas sintetizadas exhibieron una buena biocompatibilidad35.

Como Gd per se posee características biotóxicas36,37,38, surgió la pregunta de si el dopaje con Gd contribuía o no a la toxicidad de las nanopartículas. No hay datos disponibles en la literatura sobre la toxicidad comparativa de las CD-Gd y sus precursores libres de Gd no funcionalizados.

Teniendo en cuenta los hechos mencionados anteriormente, los objetivos de este estudio fueron: (*) una evaluación de toxicidad multinivel de nuevos nanohíbridos ultrapequeños dopados con Gd a base de carbono a partir de residuos de café (cofNH) obtenidos sobre la base de la química verde, y (* *) una comparación de la toxicidad de cofNHs con su precursor, CDs libres de Gd no funcionalizados a partir de residuos de café (cofCDs); utilizando enfoques metodológicos hematológicos, bioquímicos e histopatológicos tras la administración in vivo de las nanopartículas, y estudio de neurotoxicidad aguda in vitro. Este último caracterizó los efectos comparativos de cofCD y cofNH en la característica crucial de la neurotransmisión glutamato y GABA-érgica utilizando terminales nerviosas aisladas de la corteza de rata (sinaptosomas), que son uno de los mejores sistemas modelo para explorar los procesos presinápticos39.

No se observó toxicidad en ningún grupo de animales de experimentación. Tampoco se observó mortalidad en los grupos control y cofCD, sin embargo, 1 ratón murió en el grupo cofNH al sexto día del estudio. Además, todos los animales, excepto el que murió, demostraron un aumento de peso corporal consecutivo sin diferencias estadísticamente significativas entre los grupos, lo que podría sugerir el bienestar de los ratones y la ausencia de toxicidad de las nanopartículas probadas si se aplican en las dosis descritas durante 14 días (Fig. 1).

Dinámica del peso corporal (cambios de peso corporal absolutos (a) y relativos (b)) de ratones de control y aquellos tratados con cofCD y cofNH durante 14 días.

De acuerdo con los datos que se muestran en la Fig. 2, la aplicación de cofCD y cofNH provocó una tendencia al aumento en el porcentaje de linfocitos (LYM) (p = 0.129 y p = 0.071, respectivamente) con una disminución concomitante en los porcentajes de granulocitos neutrófilos (GRAN) (p = 0,179 y p = 0,063, respectivamente). Estos cambios suelen ser evidencia de algún proceso inflamatorio específico en el organismo, como infección viral o bacteriana crónica, trastornos autoinmunes40. Sin embargo, si no hay cambios en el recuento absoluto de glóbulos blancos, podríamos asumir más bien un cambio en la respuesta inmune, pero no una verdadera inflamación. Puede producirse un aumento del % LYM en caso de trastornos autoinmunes como consecuencia de la estimulación de los linfocitos. De hecho, los CD podrían causar ese impacto41. Por lo tanto, sugerimos que los cambios observados podrían evidenciar algún cambio en la respuesta inmune contra las nanopartículas probadas. Sin embargo, nos gustaría notar que los valores observados todavía estaban dentro del rango normal típico de los ratones CD-142.

Parámetros hematológicos de los ratones de control y los tratados con cofCD y cofNH durante 14 días en el día final del estudio. *p < 0,05, **p < 0,01.

El recuento de eritrocitos (RBC) y los parámetros relacionados (valores de hemoglobina (HGB), hematocrito (HCT) y concentración media de hemoglobina corpuscular (MCHC)) demostraron valores reducidos tanto para cofCD como para cofNP de manera similar. La disminución de RBC, HGB, HCT y MCHC podría evidenciar la inhibición de la eritropoyesis, y Gd probablemente no contribuye a este proceso. Entonces, el aumento del volumen plaquetario medio (MPV) con la disminución concomitante del recuento de plaquetas (PLT) en ambos grupos podría evidenciar la alteración del proceso de maduración de las plaquetas y, nuevamente, no se supone que Gd sea el principal contribuyente a eso. En conjunto, hay algunas evidencias de inflamación y violación de la eritropoyesis y la formación de plaquetas, y parece que el núcleo de carbono es el principal contribuyente a estos procesos, y Gd no agrega toxicidad adicional a eso.

De acuerdo con los datos presentados en la Fig. 3, no hay cambios significativos en las actividades de las enzimas hepáticas, lo que podría evidenciar que no hay un impacto sustancial tanto de las cofCD como de las cofNP en la función hepática43. Disminución de la urea en los grupos tratados con cofCD y cofNH junto con una tendencia a la disminución de la proteína total (p = 0,147 y p = 0,129, respectivamente). Dichos datos podrían evidenciar una deficiencia de proteínas en el organismo debido a una mala ingesta de proteínas o malabsorción, o algunos problemas con la síntesis y el metabolismo de las proteínas, que tienen lugar en el hígado44. Dado que los ratones de todos los grupos aumentaron de peso continuamente a lo largo del estudio (Fig. 1), por lo tanto, se puede excluir la desnutrición. Por lo tanto, la razón de la disminución de la urea en el suero podría ser una consecuencia de un metabolismo de proteínas alterado. Cabe señalar, sin embargo, que a pesar de los cambios significativos en comparación con el control, los valores de urea sérica estaban dentro del rango normal, típico de los ratones CD-142.

Parámetros bioquímicos séricos de ratones de control y aquellos tratados con cofCD y cofNH durante 14 días en el día final del estudio. **p < 0,01 en comparación con el control.

La ausencia de cambios en la concentración de creatinina sérica podría evidenciar ningún impacto en la función renal. En conjunto, tanto las cofCD como las cofNP podrían conducir a la inhibición de la síntesis de proteínas, pero estas nanopartículas en dosis aplicadas no causaron una violación sustancial de las funciones hepática y renal.

De acuerdo con los datos histopatológicos presentados en las Tablas 1, 2 y 3 y en la Fig. 4, tanto las cofCD como las cofNH no afectaron sustancialmente los estados del hígado, los riñones y el bazo de esa manera que podría considerarse como la lesión. Sin embargo, todavía hubo algunos cambios estructurales. Por lo tanto, tanto los cofCD como los cofNH indujeron leves signos inflamatorios en el hígado, manifestados por una ligera acumulación de células de Kupffer en todo el tejido y ocasionales loci de acumulación de leucocitos, lo que está en línea con nuestros hallazgos hematológicos. En el grupo tratado con cofNH, a veces también se produjo congestión de los vasos sanguíneos.

Microfotografías de riñón, hígado y bazo de ratones de control y aquellos tratados con cofCD y cofNH. Ampliación ×100, H&E. Escala 100 µm.

En los riñones, se observó una ligera pérdida del borde en cepillo del epitelio tubular en los grupos tratados con cofCD y cofNH, lo que, sin embargo, no afectó la función renal, como lo demuestran los niveles de creatinina y urea sérica. Además, en estos dos grupos se produjo una ligera hiperplasia tubular que, a pesar de ocurrir durante una nefropatía crónica progresiva, se considera un signo de proliferación de células tubulares y regeneración de túbulos45. Por lo tanto, se podría concluir que los riñones se vieron afectados por los compuestos probados, pero se estaban regenerando con éxito. Luego, en el grupo tratado con cofNH en ocasiones se producía dilatación de los vasos sanguíneos, lo que es similar al hallazgo en el hígado, y podría evidenciar alguna alteración en el riego sanguíneo de estos órganos.

Los cambios histopatológicos en el bazo fueron similares en los ratones tratados con cofCD y cofNP. Se observó hiperplasia de la zona marginal (leve) y megacariocitosis a medida que aumentaba el número de megacariocitos (de leve a moderado), así como ocasionales loci necróticos. La hiperplasia de la zona marginal podría evidenciar alguna activación del sistema fagocítico debido a que está poblada predominantemente por macrófagos45. Nuestros datos sobre la acumulación potencial de nanopartículas en el bazo están en línea con la literatura46, 47. La megacariocitosis es común en caso de violación de la maduración y diferenciación plaquetaria48, lo que confirma nuestra sugerencia basada en hallazgos hematológicos.

Por lo tanto, podría sugerirse una seguridad relativa tanto de cofCD como de cofNH para riñón, hígado y bazo. Sin embargo, hubo algunas preocupaciones sobre la maduración de las plaquetas y la eritropoyesis, así como un ligero proceso inflamatorio en el hígado causado predominantemente por el núcleo de carbono. Sin embargo, estos cambios fueron mínimos, por lo que podrían no ser un obstáculo para múltiples aplicaciones de cofCD o cofNH. Entonces, la captura fuerte de Gd por el núcleo de cofCD podría concluirse debido a que no hay diferencias en los valores bioquímicos, hematológicos e histopatológicos en los grupos tratados con cofCD y cofNH.

El potencial de membrana se controló utilizando el colorante fluorescente sensible al potencial rodamina 6G. Fst, el índice de potencial de membrana en el nivel de estado estacionario, se logró durante 5 minutos y se estableció en 100% en los cálculos estadísticos. En los experimentos fluorimétricos que se muestran en la Fig. 5a, b, se reveló que tanto los cofCD como los cofNH no cambiaron el potencial de membrana de las terminales nerviosas y, por lo tanto, no despolarizaron su membrana plasmática. Para comparar, el curso temporal de la despolarización de la membrana de las terminaciones nerviosas inducida por KCl (35 mM) se presentó en la Fig. 5.

Experimentos de fluorescencia: el potencial de membrana de las terminales nerviosas en presencia de cofCD y cofNH. (a) La suspensión de sinaptosomas se equilibró con el colorante rodamina 6G (0,5 mM) sensible al potencial; cuando se alcanzó el nivel estable de la fluorescencia del colorante, se añadieron a los sinaptosomas el SSS (el control), cofCD (0,01 mg/ml), cofNH (0,01 mg/ml) y KCl (35 mM) (marcado por la flecha). . Las trazas son típicas y representan 12 experimentos realizados con diferentes preparaciones de sinaptosomas. (b) Un aumento en la señal de fluorescencia de la rodamina 6G en respuesta a la aplicación de cofCD (0,01 mg/ml), cofNH (0,01 mg/ml) y KCl (35 mM). Los datos son la media ± SEM. ***, p < 0,001 con respecto al control; ns, sin diferencias significativas; n = 12.

Los transportadores de glutamato y GABA dependientes de Na+ son actores estratégicos en la neurotransmisión sináptica que media la captación de neurotransmisores en el citoplasma de las terminaciones nerviosas presinápticas y el establecimiento del nivel extracelular adecuado de los neurotransmisores. Este último es un parámetro sináptico crucial que representa un equilibrio dinámico dependiente de la energía entre los valores de la captación mediada por el transportador y la fuga no estimulada de los neurotransmisores49, 50.

Como se muestra en la Tabla 4, el nivel extracelular de L-[14C]glutamato en las preparaciones de terminales nerviosas no cambió con las cofCD y cofNH a una concentración de 0,01 mg/ml.

Como se muestra en la Tabla 5, el nivel extracelular de [3H]GABA en preparaciones de terminales nerviosos no cambió significativamente por cofCDs y cofNHs a una concentración de 0,01 mg/ml. Estos resultados están de acuerdo con los datos anteriores de L-[14C]glutamato. Sin embargo, cabe señalar que los cofNH tenían una fuerte tendencia a aumentar el nivel extracelular de [3H]GABA en el sinaptosoma a esta concentración.

En la siguiente serie de experimentos, se evaluaron los efectos de Gd3+ en el nivel extracelular de L-[14C]glutamato y [3H]GABA en preparaciones de terminales nerviosas. Se encontró que Gd3+ a concentraciones de 1 y 10 µM Gd3+ en relación con su contenido en cofNHs no cambió significativamente el nivel extracelular de L-[14C]glutamato y [3H]GABA en preparaciones de terminales nerviosas (Tabla 6). Sin embargo, cabe señalar que Gd3+ a concentraciones de 10 µM tenía una fuerte tendencia a aumentar el nivel extracelular del sinaptosoma tanto de L-[14C]glutamato como de [3H]GABA.

Aquí, se realizó una evaluación comparativa de la toxicidad general y la neurotoxicidad aguda de cofCD y cofNH en experimentos in vivo e in vitro, respectivamente. Los resultados de la bioquímica sérica no revelaron cambios en las principales enzimas hepáticas, lo que podría evidenciar una toxicidad sustancial contra este órgano, sin embargo, se observaron algunos signos inflamatorios. La disminución de la urea en ambos grupos junto con una tendencia a la disminución de la TP podría evidenciar una inhibición de la síntesis de proteínas. Tomados juntos, ambos compuestos en dosis aplicadas no causaron una violación sustancial de las funciones hepática y renal. Los datos hematológicos demostraron un aumento del LYM% y una disminución concomitante del GRAN% en ambos grupos que podrían evidenciar algún proceso inflamatorio en el organismo y confirmaron nuestros hallazgos histopatológicos en el hígado. La disminución (significativa o secundaria) de RBC, HGB, HCT y MCHC en los grupos cofCD- y cofNH- podría evidenciar una inhibición de la eritropoyesis, y Gd apenas contribuyó a ello; el aumento del MPV con la disminución concomitante de PLT podría evidenciar la alteración del proceso de maduración de las plaquetas, lo cual está en línea con los hallazgos histopatológicos en el bazo. En conjunto, hubo algunas evidencias de inflamación y violación de la eritropoyesis y formación de plaquetas. Como casi no se observaron diferencias en los valores bioquímicos, hematológicos e histopatológicos en el grupo tratado con cofNH en comparación con el tratado con cofCD, podemos concluir que el núcleo de cofCD probablemente contribuye mucho a estos procesos.

Nuestros datos experimentales sobre la toxicidad general de los cofNH están de acuerdo con los datos de la literatura. En particular, se comparó la toxicidad potencial de Gd-CD y Gd-DTPA (agente de contraste ampliamente utilizado) en ratones inyectados con Gd-CD (concentración de Gd de 5 mg/kg) y Gd-DTPA a través de la vena de la cola. En el análisis bioquímico del suero sanguíneo, las muestras de sangre se recolectaron durante un período de 1 a 21 días. Se reveló que los Gd-CD exhibieron un efecto similar en comparación con el Gd-DTPA. El análisis de los indicadores renales, el nitrógeno ureico en sangre y la creatinina no revelaron diferencias entre el grupo de control y el de Gd-CD, lo que demuestra la ausencia de daño en la función renal. En el análisis de la función hepática, los valores de AST y ALT aumentaron ligeramente después de la inyección de 1 día. Los indicadores hepáticos, albúmina y proteínas totales, se mantuvieron en niveles normales. Gd-CD y Gd-DTPA pueden afectar la función hepática poco después de la inyección sin daño significativo de los tejidos hepáticos, porque el hígado podría recuperar rápidamente su función después de una inyección de 7 días. En conjunto, estos resultados demostraron una baja toxicidad de Gd-CD y Gd-DTPA para los animales34. En otro estudio, la hemólisis no se reveló después de la administración de Gd-CD (preparados usando el método hidrotermal con ácido 3,4-dihidroxihidrocinámico, 2,2′-(etilendioxi)bis(etilamina) y cloruro de Gd), mostrando así poco daño a la red células sanguíneas y biocompatibilidad con la sangre. El análisis histológico de los órganos después de 24 h después de la inyección de Gd-CD en un estudio de toxicidad in vivo no reveló daños evidentes en los grupos tratados con Gd-CD, como respuesta inflamatoria, fibrosis pulmonar, necrosis o daños en los órganos principales. La toxicidad a largo plazo in vivo en un modelo de ratones Kunming sanos durante 16 días reveló que las Gd-CD no inducían trastornos hepáticos o renales evidentes en ratones basándose en la evaluación de TP, ALT, AST, ALP, nitrógeno ureico en sangre, colesterol total y triglicéridos . La histopatología de los ratones tratados con Gd-CDs no reveló anormalidades histopatológicas aparentes o lesiones observadas en el corazón, riñón, hígado y bazo, en comparación con el control. No se revelaron signos de necrosis en las muestras histológicas. En los tejidos pulmonares, se demostraron infiltrados celulares peribronquiales y perivasculares que indicaron respuestas inflamatorias pulmonares moderadas. Se concluyó que las Gd-CD exhibieron una buena biocompatibilidad in vivo y pueden ser adecuadas para bioaplicaciones adicionales31. No se observó ningún fenómeno de hemólisis estudiando la hemocompatibilidad de Gd-CDs conjugadas con aptámeros AS1411 (AS1411-Gd-CDs). Se ha concluido que AS1411-Gd-CDs poseía la maravillosa biocompatibilidad en cuanto a la aplicación en el campo biológico35.

En un estudio de neurotoxicidad aguda in vitro, los cofCD no afectaron los niveles ambientales de L-[14C]glutamato y [3H]GABA en preparaciones de terminales nerviosas a una concentración de 0,01 mg/ml. Los CofNH no afectaron el nivel extracelular de L-[14C]glutamato, pero tienen una tendencia a aumentar el de [3H]GABA a esta concentración. La evaluación de la contribución de Gd reveló que los iones Gd3+ en concentraciones relacionadas no mostraron cambios significativos, sin embargo, tenían una tendencia a aumentar los niveles extracelulares de ambos neurotransmisores en preparaciones de terminales nerviosas. A pesar de que los cofNH no pudieron mitigar la neurotoxicidad del Gd a esta concentración (ambos no son tóxicos), la presencia de Gd incorporado en la estructura del cofNH permite que el Gd se acumule en el tumor en aplicaciones biomédicas basadas en el fenómeno de nanopartículas de acumulación tumoral. Los resultados de neurotoxicidad de CofCD coinciden con nuestros experimentos previos en CD en concentraciones relacionadas obtenidas de β-alanina y CD que contienen azufre de tiourea y ácido cítrico27, 28. En particular, los CD de β-alanina en concentraciones de 0.01 mg/ml no influyeron en nivel extracelular de L-[14C]glutamato y [3H]GABA en preparaciones de terminales nerviosas27. Las CD que contienen azufre de tiourea y ácido cítrico tampoco tuvieron efectos sobre el nivel extracelular del sinaptosoma de ambos neurotransmisores28.

Los datos de neurotoxicidad aguda in vitro en CofNH están de acuerdo con los datos de la literatura. En el estudio de citotoxicidad in vitro con células de riñón embrionario humano (293 células T) y ensayo CCK-8, Gd-CD (preparado mediante método hidrotermal con ácido 3,4-dihidroxihidrocinámico, 2,2′-(etilendioxi)bis(etilamina) y cloruro de Gd) incluso a una alta concentración de 1 mg/mL no cambió la viabilidad celular después de 24 h de incubación, lo que indicó su baja citotoxicidad in vitro31. En otro estudio, se demostró que las Gd-CD obtenidas mediante un método hidrotermal de un solo paso tenían una citotoxicidad discreta32. En particular, utilizando células NIH3T3 y 4T1 y el ensayo CCK-8, se demostró que las células conservaron una alta viabilidad después de 24 h de coincubación, lo que indica que las Gd-CD conjugadas con aptámeros AS1411 indujeron una toxicidad insignificante35.

En perspectiva, planeamos optimizar los enfoques metodológicos y realizar un estudio de neurotoxicidad aguda a concentraciones significativamente más altas (50 veces) de cofCD y cofNH para confirmar o no si la tendencia a aumentar el nivel extracelular de [3H]GABA en preparaciones de terminales nerviosas por cofNHs ( Tabla 4) dio como resultado un aumento significativo en este parámetro. Esto se debe a que se aplicó una concentración relativamente baja de cofCD y cofNH en experimentos in vitro (en comparación con nuestro estudio anterior relacionado con CD27, 28) debido a la falta de transparencia y al color marrón de estas nanopartículas. Las concentraciones de iones Gd3+ relacionadas con nanopartículas (Tabla 5) aplicadas a las terminaciones nerviosas tampoco fueron altas. Sin embargo, estas concentraciones de nanopartículas se interrelacionaron con las concentraciones de cofCD y cofNH utilizadas en estudios animales in vivo y son aplicables para posibles imágenes de resonancia magnética en animales. La posible capacidad de los cofNH para aumentar el nivel de [3H]GABA extracelular en preparaciones de terminales nerviosas se puede utilizar como característica teranóstica neuroquímica adicional. Teóricamente, un compuesto que no afecta el nivel de glutamato ambiental pero aumenta el nivel de GABA ambiental en las terminales nerviosas puede tener efectos antiepilépticos, sedantes e hipnóticos.

EGTA, EDTA, HEPES, Ficoll 400, Sigma-Fluor® High Performance LSC Cocktail, las sales de grado analítico se adquirieron de Sigma (EE. UU.); L-[14C]glutamato y [3H]GABA (ácido γ-[2,3-3H(N)]-aminobutírico) eran de Perkin Elmer (Waltham, MA, EE. UU.). La rodamina 6G se obtuvo de Molecular Probes (EE. UU.).

La síntesis "verde" asistida por microondas de cofCD y cofNH a partir de residuos de café se llevó a cabo de acuerdo con una técnica similar a la descrita en el estudio51 con etapas de purificación adicionales. En particular, se empaparon 5 g de lechada de café con solución de GdCl3 0,1 M, se secaron, se empaparon con solución de NH4OH al 10 % y se sinterizaron durante 10 min en horno microondas en un matraz de fondo redondo de 250 ml al aire, lo que permitió proceder simultáneamente a la amoxidación. reacciones e interacción de fragmentos hidrolizados entre sí gracias a reacciones de Maillard, condensación aldólica, alquilación de fenoles, deshidratación de los carbohidratos, etc. Los átomos de gadolinio pueden ser retenidos por grupos carboxílicos así como por grupos hidroxilo de derivados del ácido hidroxicinámico abundantes en el café52, 53. Luego, las nanopartículas se resuspendieron en agua destilada, se filtraron a través de concentradores Vivaspin 20® con membranas de polietersulfona (PES) de diferentes tamaños de poro para obtener una fracción inferior a 30 kDa de peso molecular, se dializaron a través de una membrana de 3.500 MWCO (ZelluTrans ROTH® Regenerated Cellulose Membrana Tubular), y preconcentrado utilizando Vivaspin 20® de 3.000 MWCO para obtener nanopartículas en el rango de 3-30 kDa. Sus propiedades físicas y químicas se caracterizaron parcialmente 54, así como las imágenes TEM (ver Fig. S1) y los espectros FTIR (Fig. S2) se proporcionan en Información complementaria.

En el estudio se utilizaron ratones CD1 hembra, de 10 a 11 semanas de edad, con un peso corporal inicial de 19,6 ± 3,0 g. Los animales se mantuvieron en las instalaciones para animales de la Universidad Nacional Taras Shevchenko de Kiev bajo iluminación natural a 20-23 °C y acceso gratuito a una dieta estandarizada para roedores y agua del grifo. Todos los experimentos se realizaron de conformidad con los principios de bioética, las normas legislativas y las disposiciones del Convenio Europeo para la Protección de los Animales Vertebrados utilizados con Fines Experimentales y Otros Fines Científicos55, Principios Éticos Generales para Experimentos con Animales, adoptado por el Primer Congreso Nacional de Bioética (Kiev, 2001), y aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (Protocolo #1, 24 de junio de 2021).

Los animales (ratas Wistar, machos, 12 semanas de edad, peso corporal de aproximadamente 120 g) se mantuvieron en las instalaciones para animales del Instituto Palladin de Bioquímica, Academia Nacional de Ciencias de Ucrania, se les proporcionó agua ad libitum y dieta estandarizada para roedores, y se alojaron en una habitación con temperatura controlada a 22–23 °C. Los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las Directrices de la Comunidad Europea (2010/63/EU) y las leyes/políticas locales, y fueron aprobados por el Comité de Uso y Cuidado de Animales del Instituto de Bioquímica Palladin (Protocolo n.° 1 del 21 de septiembre de 2020). Todos los estudios con animales se informaron de acuerdo con las pautas ARRIVE para informar experimentos con animales56, 57. El número total de ratas utilizadas en el estudio fue 12, específicamente, las mediciones de los niveles extracelulares de L-[14C]glutamato y [3H] GABA en terminales nerviosas - 12 animales; y los experimentos de fluorimetría compartieron estos 12 animales.

Los ratones se asignaron aleatoriamente a 3 grupos de tratamiento (n = 5 en cada uno) y recibieron cofCD y cofNH disueltos en solución salina tamponada con fosfato (PBS) en una concentración de 25,0 mg/ml, o PBS puro (grupo de control) por vía intraperitoneal en un volumen de 5 ml/ kg (que corresponde a dosis de cofCD y cofNH de 125 mg/kg cada una) diariamente durante 14 días consecutivos, de acuerdo con las recomendaciones para estudios de toxicidad de dosis repetidas para el desarrollo preclínico de fármacos58, 59. En el día 15 del estudio, los ratones fueron anestesiados por 2,2,2-tribromoetanol (250 mg/kg) y sacrificado por dislocación cervical.

Se controló diariamente el estado general y el peso corporal de los ratones. Se evaluó el estado externo de la piel y pelaje, ojos, mucosas, sistema respiratorio, postura y cambios en la actividad espontánea. El sistema de puntuación detallado se presenta en la Tabla 7. Las observaciones se realizaron inmediatamente después de la primera administración y una vez al día durante el período de observación.

La sangre para el análisis hematológico se recolectó inmediatamente después del sacrificio por punción cardíaca, se transfirieron 25 µl de sangre fresca a tubos con igual volumen de solución de K2EDTA al 0,4% en solución salina. La evaluación de los parámetros hematológicos se realizó utilizando el analizador de hematología MCL-3124 (Guangzhou Mecan Trading Co., Ltd, China) y reactivos consumibles Cormay (Polonia) dentro de las dos horas posteriores a la extracción de sangre. Recuento de glóbulos blancos (WBC), linfocitos (LYM), células de tamaño medio (monocitos, eosinófilos y basófilos, MID), valores absolutos y relativos de neutrófilos (GRAN), recuento de eritrocitos (RBC), hemoglobina (HGB), hematocrito ( Se midieron HCT), recuento de plaquetas (PLT) y volumen medio (MPV).

La sangre para el análisis bioquímico se recolectó inmediatamente después del sacrificio por punción cardíaca, se dejó durante 60 min para formar un coágulo de fibrina y luego se centrifugó a 5400 g durante 20 min a 4 °C. Se recogió suero sanguíneo y se usó inmediatamente para determinar el valor de alanina aminotransferasa (ALT), aspartato aminotransferasa (AST), γ-glutamil transpeptidasa (GGT), lactato deshidrogenasa (LDH), fosfatasa alcalina (ALP), urea, creatinina y proteínas totales (PT). Los análisis se realizaron en un analizador químico completamente automático MF-240 (MedFuture LLC, EE. UU.) utilizando kits de reactivos estándar (Cormay, Polonia) de acuerdo con los protocolos proporcionados por el fabricante.

Las muestras de hígado, riñón y bazo se recogieron inmediatamente después del sacrificio y se fijaron en formalina tamponada neutra al 10% durante 7 días. Después de la fijación en formalina, las muestras fueron deshidratadas en soluciones de etanol e incluidas en parafina, cortadas para obtener los portaobjetos de 5 µm de espesor, que fueron desparafinados y teñidos con hematoxilina y eosina (H&E) según métodos estándar60, y examinados al microscopio óptico por patólogo que desconocía los grupos de tratamiento. Las características patológicas se evaluaron de manera semicuantitativa, los sistemas de puntuación detallados se presentan en la Tabla 8.

La región cerebral de la corteza aislada de ratas decapitadas se eliminó inmediatamente y luego se homogeneizó en solución salina helada que contenía sacarosa 0,32 M, HEPES-NaOH 5 mM, pH 7,4 y EDTA 0,2 mM. Se obtuvo una preparación de sinaptosoma de una rata y cada medición se realizó por triplicado. Las preparaciones de sinaptosomas se obtuvieron utilizando centrifugaciones diferenciales y en gradiente de densidad Ficoll-400 de homogeneizado de cerebro de rata según 61,62,63. Las preparaciones de sinaptosomas se utilizaron en los experimentos durante 2 a 4 h. La solución salina estándar (SSS) contenía (en mM): NaCl 126; KCl5; MgCl2 2,0; NaH2PO4 1,0; HEPES 20, pH 7,4; D-glucosa 10. La concentración de proteína se examinó de acuerdo con64.

Las preparaciones de sinaptosomas se diluyeron en SSS para alcanzar una concentración de 2 mg de proteína/ml, y después de la preincubación a 37 °C durante 10 min se cargaron con L-[14C]glutamato (2,81 μM, 1 μCi/ml) en SSS a 37 °C durante 10 min. Después del procedimiento de carga, las suspensiones de sinaptosomas se lavaron con 10 volúmenes de SSS enfriado con hielo; los sedimentos se resuspendieron en SSS para alcanzar una concentración final de 1 mg de proteína/ml. Se preincubaron suspensiones de sinaptosomas (125 μl; 0,5 mg de proteína/ml) a 37 °C durante 10 min, luego se agregaron las alícuotas de cofCDs y cofNHs y se incubaron con sinaptosomas durante 10 min, y luego se sedimentaron con una microcentrífuga (20 s a 10.000 g). El nivel extracelular de L-[14C]glutamato se registró en las alícuotas de sobrenadantes (100 μl) y gránulos mediante recuento de centelleo líquido con Sigma-Fluor® High Performance LSC Cocktail (1,5 ml) y contador de centelleo líquido Hidex 600SL (Finlandia), y los valores se expresaron como el porcentaje de L-[14C]glutamato de sinaptosoma total acumulado65, 66. Los datos de L-[14C]glutamato se recopilaron por triplicado de varios (n) experimentos independientes realizados con diferentes preparaciones de sinaptosomas.

Las preparaciones de sinaptosomas se diluyeron en SSS hasta 2 mg de proteína/ml, y después de su preincubación a 37 °C durante 10 min se cargaron con [3H]GABA (50 nM, 4.7 µCi/ml) en SSS para 10 minutos. Se utilizó ácido aminooxiacético inhibidor de la transaminasa GABA a una concentración de 100 µM durante los experimentos de carga y liberación de [3H]GABA para minimizar la formación de metabolitos de GABA. Después de la carga, las suspensiones de sinaptosomas se lavaron con 10 volúmenes de SSS enfriado con hielo. Los gránulos se resuspendieron en SSS para tener una concentración de proteína de 1 mg/ml. Las suspensiones de sinaptosomas (120 µl) se preincubaron a 37 °C durante 10 min, luego se agregaron las alícuotas de cofCD y cofNH, se incubaron durante 10 min y se sedimentaron con una microcentrífuga (20 s a 10 000 g). Se registró el nivel extracelular de [3H]GABA en preparaciones de sinaptosomas. La radiactividad de [3H]GABA se midió en las alícuotas de los sobrenadantes (90 µl) mediante recuento de centelleo líquido con Sigma-Fluor® High Performance LSC Cocktail (1,5 ml) y contador de centelleo líquido Hidex 600SL (Finlandia), y los valores se expresaron como la porcentaje de sinaptosoma total acumulado [3H]GABA67. Los datos de [3H]GABA se recopilaron por triplicado a partir de varios (n) experimentos independientes realizados con diferentes preparaciones de sinaptosomas.

El potencial de membrana de los sinaptosomas en presencia de cofCD y cofNH se midió utilizando el colorante fluorescente potenciométrico rodamina 6G (0,5 µM) basado en su unión dependiente del potencial a las membranas68,69,70. La suspensión de sinaptosomas (una concentración final de 0,2 mg de proteína/ml) se preincubaron a 37 °C durante 10 min y luego se agregaron a una cubeta termostatizada con agitación continua. La suspensión de sinaptosomas se equilibró con la sonda y se añadieron las alícuotas de cofCD y cofNH. Para estimar los cambios en el potencial de membrana plasmática se calculó el cociente (F) como índice del potencial de membrana según la Ec.: F = Ft/F0, donde F0 y Ft son intensidades de fluorescencia de un colorante fluorescente en ausencia y presencia del sinaptosomas, respectivamente. F0 se calculó por extrapolación de la función de decaimiento exponencial a t = 0. Las mediciones de fluorescencia con rodamina 6G se realizaron utilizando un espectrofluorímetro Hitachi MPF-4 a longitudes de onda de 528 nm (excitación) y 551 nm (emisión) (bandas de hendidura de 5 nm cada una).

Se utilizó el software GraphPad Prism 9.0.0 para el análisis estadístico y la visualización de datos. La homogeneidad de la varianza se evaluó mediante la prueba de Levene. Los datos experimentales se expresaron como la media ± SEM de n experimentos independientes. La diferencia entre dos grupos se comparó mediante análisis de varianza de una vía (ANOVA) con la prueba post hoc de Tukey. Se utilizó la prueba U de Mann-Whitney para muestras independientes para el análisis de las puntuaciones de los signos histopatológicos. Las diferencias se consideraron significativas, cuando p < 0,05.

Se realizó un estudio de toxicidad a corto plazo (14 días de la administración), lo que no permite establecer una conclusión estricta sobre la ausencia de toxicidad retardada de los productos químicos probados. Sin embargo, dado que el objetivo principal de los nanomateriales dopados con Gd es la aplicación de bioimagen, es decir, la administración única, los términos utilizados en este estudio de toxicidad permiten al menos excluir la toxicidad aguda de las nanopartículas y, por lo tanto, podrían ser la base para realizar investigaciones preclínicas en animales de estas productos químicos durante la administración a largo plazo.

En resumen, una evaluación comparativa de toxicidad multinivel mostró una seguridad relativa tanto de cofCD como de cofNH para riñón, hígado y bazo. Hubo algunas preocupaciones acerca de la maduración plaquetaria y la eritropoyesis, así como la posible afectación del hígado, pero la incorporación de Gd era poco probable que estuviera relacionada con eso. En total, los cofNH han demostrado cambios mínimos en los ensayos bioquímicos y hematológicos del suero que no son un obstáculo para la aplicación biomédica de los cofNH. Además, las cofCD y cofNH no influyeron en los niveles extracelulares de L-[14C]glutamato y [3H]GABA en preparaciones de terminales nerviosas, por lo que no presentaron signos de neurotoxicidad aguda. En conjunto, se puede considerar que los cofNH se pueden analizar más en la investigación biomédica como agente teragnóstico en perspectiva.

Los conjuntos de datos utilizados durante el estudio actual están disponibles del autor correspondiente a pedido razonable. Parcialmente, los datos sobre la síntesis de nanopartículas están disponibles en las Actas de C'Nano 2023: The Nanoscience Meeting; Poitiers, 2023; pag. 24

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Esta investigación fue financiada por el Programa de Intercambio de Personal de Investigación e Innovación Horizonte 2020 de la UE (RISE) bajo la Acción Marie Skłodowska-Curie (proyecto 101008159 "UNAT"), y la subvención de la Fundación Nacional de Investigación de Ucrania, Proyecto #2021.01/0061 (AP, MD , TB − evaluación de la neurotoxicidad de nanopartículas de carbono obtenidas por calentamiento de compuestos orgánicos).

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Halyna Kuznietsova, Natalia Dziubenko, Konstantin Paliienko, Tetiana Lysenko, Valeriy Skryshevsky y Tatiana Borisova

Instituto de Altas Tecnologías, Universidad Nacional Taras Shevchenko de Kiev, Volodymyrska Street, 64, Kyiv, 01601, Ucrania

Halyna Kuznietsova, Natalia Dziubenko y Valeriy Skryshevsky

Instituto Palladin de Bioquímica Academia Nacional de Ciencias de Ucrania, 9 Leontovicha Street, Kiev, 01054, Ucrania

Konstantin Paliienko, Natalia Pozdnyakova, Natalia Krisanova, Artem Pastukhov, Tetiana Lysenko, Marina Dudarenko y Tatiana Borisova

Instituto de Materia Ligera, UMR-5306, Universidad Claude Bernard de Lyon/CNRS, Universidad de Lyon, 69622, Villeurbanne Cedex, Francia

vladimir lysenko

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Conceptualización, TB, VL, VS, HK, ND; Metodología, KP, VL, HK, ND, NP, NK, AP, TL, MD, TB; Análisis formal, TB, HK, ND, NP, NK; Investigación, KP, HK, ND, NP, NK, AP, MD; Curación de datos, KP, VL, TB, HK, ND, NP, NK; Escritura—Preparación del borrador original, TB; Supervisión, VS,VL, TB; Redacción: revisión y edición, TB, HK, ND, NP, KP, VS; Adquisición de fondos, VS, VL Todos los autores han leído y están de acuerdo con la versión publicada del manuscrito.

Correspondencia a Konstantin Paliienko.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Kuznietsova, H., Dziubenko, N., Paliienko, K. et al. Una evaluación comparativa de toxicidad multinivel de puntos libres de Gd a base de carbono y nanohíbridos dopados con Gd a partir de desechos de café: estudio de hematología, bioquímica, histopatología y neurobiología. Informe científico 13, 9306 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-36496-4

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Recibido: 03 Abril 2023

Aceptado: 05 junio 2023

Publicado: 08 junio 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-36496-4

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