Un conjunto de vectores y cepas para la integración cromosómica en levaduras de fisión

Nov 30, 2023

Scientific Reports volumen 13, Número de artículo: 9295 (2023) Citar este artículo

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La expresión de genes heterólogos es una técnica importante en la genética de levaduras. En la levadura de fisión, los genes leu1 y ura4 se han utilizado principalmente como marcadores seleccionables para la expresión heteróloga. Para expandir el repertorio de marcadores de selección disponibles para la expresión heteróloga de genes, aquí desarrollamos nuevos sistemas de vector huésped que emplean lys1 y arg3. Al emplear la edición del genoma con el sistema CRISPR/Cas9, aislamos varios alelos de lys1 y arg3, cada uno con una mutación crítica en la región ORF. Paralelamente, desarrollamos un conjunto de vectores que complementan la auxotrofia de aminoácidos de los mutantes lys1 y arg3 cuando se integran en cada locus. Usando estos vectores en combinación con el vector de integración pDUAL previamente desarrollado, observamos con éxito la localización de tres proteínas en una célula simultáneamente al fusionarlas con diferentes proteínas fluorescentes. Por lo tanto, estos vectores permiten la expresión combinatoria de genes heterólogos, lo que aborda desafíos experimentales cada vez más diversos.

El estudio de la biología de la levadura ha estimulado el desarrollo de sofisticados sistemas experimentales para dilucidar los mecanismos moleculares que subyacen a una variedad de fenómenos biológicos. Recientemente, para explorar estos mecanismos moleculares más profundamente, a veces se requieren sistemas experimentales complicados. En muchos casos, un experimento tan complicado requiere la expresión de múltiples transgenes en una célula. Para este propósito, se han desarrollado varios vectores, que pueden usarse como plásmidos episomales o vectores integradores, y promotores constitutivos o inducibles1, 2. Se prefieren los sistemas de expresión que pueden reproducir condiciones similares a los entornos fisiológicos. En este sentido, el uso de vectores integradores es uno de los sistemas de vanguardia utilizados en biología de levadura en lugar de vectores episomales3.

Hemos desarrollado previamente dos tipos de vectores episomales que también se pueden usar para la integración cromosómica mediante una recombinación cruzada simple4, 5. Un tipo de vector está diseñado para integrarse en los loci lys1, arg1 o his3. Cuando estos vectores se integran con éxito en los loci diana, los transformantes se vuelven auxotróficos para los aminoácidos correspondientes. El mérito de estos vectores es que pueden usarse para cepas que no tienen auxotrofia de aminoácidos. Por lo tanto, en muchos casos, estos vectores se pueden utilizar sin preparar una nueva cepa huésped. Sin embargo, el hecho de que la integración de los vectores en el genoma dé como resultado la auxotrofia de aminoácidos es una desventaja en algunos casos. Por otro lado, los vectores de la serie pDUAL están diseñados para integrarse en el locus4 leu1. Aunque pueden usarse solo para cepas que tienen el alelo leu1-32, los transformantes se vuelven prototróficos para la leucina, lo que permite una fácil selección de los transformantes (Fig. 1). El hecho de que los vectores pDUAL no contengan una copia funcional del gen leu1 evita la selección de transformantes en los que los plásmidos se integran aleatoriamente en el genoma. Aunque ambos tipos de vectores tienen sus propias ventajas y desventajas, los vectores de tipo pDUAL parecen más útiles desde el punto de vista de la selección y mantenimiento de transformantes adecuados.

Integración de pDUAL en el genoma del mutante leu1-32. Los vectores de la serie pDUAL tienen una parte del gen leu1 que contiene sitios de reconocimiento de enzimas de restricción dentro de la región ORF de leu1. Cuando se produce una recombinación cruzada simple aguas abajo del punto de mutación del alelo leu1-32, se espera que el genoma resultante tenga dos copias de leu1, una que carece de la parte 3' y la otra es un gen funcional de longitud completa. El esquema no está a escala.

En este documento, al tener en cuenta la estrategia de recombinación de cruce único de tipo pDUAL, intentamos desarrollar nuevos sistemas de vector huésped dirigidos a loci distintos de leu1. Utilizando el sistema CRISPR/Cas9 recientemente desarrollado en levadura de fisión6, aislamos con éxito cepas con mutaciones críticas de cambio de marco en lys1 o arg37, 8. También construimos vectores que podrían complementar la auxotrofia de aminoácidos de estos mutantes tras la integración específica en el cromosoma. Junto con los vectores pDUAL desarrollados anteriormente, ahora está disponible la expresión de tres transgenes en transformantes protótrofos sin usar marcadores resistentes a los medicamentos.

Las cepas de S. pombe utilizadas en este estudio se derivaron de las cepas de tipo salvaje JY743 (h– leu1-32 ura4-D18) o AM324 (h+ leu1-32). El ADN genómico de JY3 de tipo salvaje (protótrofo h90) se usó para la amplificación por PCR de fragmentos de genes para la construcción de plásmidos. Se usaron medio YE completo (extracto de levadura al 0,5 %, glucosa al 2 %, adenina 5 µg/ml) y medio mínimo SD y EMM29 para cultivar transformantes. Se usaron leucina, arginina, lisina, histidina y uracilo a una concentración final de 50 µg/ml cada uno, cuando fue necesario. EMM2 también se usó para la inducción transcripcional de ORF fusionados con proteínas fluorescentes bajo la regulación del promotor nmt110.

Los métodos genéticos para manejar la levadura de fisión se describieron previamente9. También se describió la transformación de células de S. pombe11. Los transformantes Ura+, Lys+ y Arg+ se seleccionaron en medio SD que carecía de uracilo, lisina y arginina, respectivamente. Al aislar los alelos mutantes de lys1, arg1 e his1, los transformantes se cultivaron en medio SD que contenía leucina y lisina, arginina o histidina, respectivamente.

El aislamiento de cepas con mutaciones críticas en genes implicados en las rutas de biosíntesis de aminoácidos se realizó mediante el sistema CRISPR/Cas9 según lo informado por Zhang et al.12, con ligeras modificaciones. Los plásmidos pDB4280 (n.º de catálogo 98699) y pDB4282 (n.º de catálogo 98701) para el sistema CRISPR/Cas9 de levadura de fisión se proporcionaron del depósito de Addgene. El diseño de los RNA de guía única (sgRNA) se realizó utilizando la herramienta basada en la web CRISPR4P13. Entre los sitios objetivo sugeridos por este programa, seleccionamos dos secuencias para cada gen, que se colocan relativamente cerca del extremo 5' de cada ORF. Los brazos de homología se redujeron a 30 nt en comparación con los 40 nt indicados por Zhang et al.12. Las secuencias para la hibridación con el vector molde pDB4282 se acortaron a 20 nt, en comparación con los 23 nt indicados por Zhang et al. Las secuencias de cebadores utilizadas fueron las siguientes: his1-sgRNA1 (TTGCCAAAAAACATAACCTGTACCGAAGAACAAGTCCAGGTACCTGAGTCGTTTTAGAGCTAGAAATAGC), his1-sgRNA2 (TTGCCAAAAAACATAACCTGTACCGAAGAAGGTGAGACAATGCGTGCATCGTTTTAGAGCTAGAAATAGC), arg3-sgRNA1 (TTGCCAAAAAACATAACCTGTACCGAAGAATCATGATC TCTCCGGTGACTGTTTTAGAGCTAGAAATAGC), arg3-sgRNA2 (TTGCCAAAAAACATAACCTGTACCGAAGAATCCATTCGTGATCTTAGTCGGTTTTAGAGCTAGAAATAGC), lys1-sgRNA1 (TTGCCAAAAAACATAACCTGTACCGAAGAATTTAGCCAAAGTGTGCGATCGTTTTAGAGCTAGAAATAGC) y lys1-sgRNA2 (TTGCCAAAAA) ACATAACCTGTACCGAAGAAATCCTCGTTAGTCGCATGACGTTTTAGAGCTAGAAATAGC). Cada cebador se usó en PCR en combinación con el cebador ura4-P75 (CATCTGTGTTGTACAAAATTG) para amplificar la región de pDB4282 que contiene una parte del marcador ura4, la secuencia de ribozima de cabeza de martillo y la secuencia de armazón de ARNsg12. La reacción de PCR se llevó a cabo en una escala de 20 µl y la amplificación exitosa se confirmó mediante electroforesis en gel de agarosa. El producto de la PCR (2,5 µl) se usó directamente para la transformación de la cepa huésped JY743 junto con el plásmido pDB4280 digerido con NotI y purificado por precipitación con etanol. También se usó un microgramo de ADN de esperma de salmón para la transformación. Los transformantes se cultivaron en una placa SD que contenía leucina e histidina, arginina o placa para preparar placas maestras. A continuación, se confirmó la auxotrofia de aminoácidos de los transformantes rayándolos en la placa SD que carecía de un aminoácido correspondiente.

Todos los mutantes lys1 y arg3 utilizados en este estudio se depositaron en el Centro de recursos genéticos de levadura (YGRC/NBRP) de Japón, junto con las cepas obtenidas de mutantes lys1-K24 o arg3-R25 mediante cruces genéticos con mutantes ade6 y ura4. A las cepas se les han asignado los ID de acceso FY47712-FY47734.

El análisis de secuencia de los alelos auxotróficos de lisina se realizó como se describe a continuación. La región alrededor del sitio objetivo de sgRNA se amplificó mediante PCR utilizando el genoma de cada candidato. Los cebadores utilizados para la amplificación de la región alrededor de los sitios diana de lys1-sgRNA#1 y lys1-sgRNA#2 fueron lys1-F-puc119 (CTCTAGAGGATCCCCTTGACACTCTCCGTTAC) y lys1-R-puc119 (TCGAGCTCGGTACCCCACCGATAGGACCTGTAA). Los fragmentos de PCR resultantes se clonaron en el vector pUC119 mediante la técnica de clonación de reparación de brechas14. Los insertos completos se secuenciaron utilizando un analizador de ADN 3730xl (Applied Biosystems).

También se realizó un análisis de secuencias para los alelos mutantes de his1 y arg3 de manera similar. Los cebadores utilizados fueron los siguientes: arg3-F-puc119 (CTCTAGAGGATCCCCGCAGTCTGAGAGAGAACTAG) y arg3-R-puc119 (TCGAGCTCGGTACCCGTCTTTAGAAGCCTGTGTC) para arg3; y his1-F-puc119 (CTCTAGAGGATCCCCTGCATAGAGGGTCGTTT) y his1-R-puc119 (TCGAGCTCGGTACCCCGAGTGAATGCTGAGGA) para his1. Los productos de la PCR se clonaron en el vector pUC119 de E. coli digerido con SmaI.

Para construir el vector pCLys1, reemplazamos el fragmento leu1 de pDUAL que contiene el promotor nmt14 con una parte del gen lys1 que contiene el promotor lys1 y la parte 5' de su ORF. Esta región se amplificó mediante PCR usando el ADN genómico de la cepa JY3 de S. pombe de tipo salvaje. El sitio de reconocimiento de la enzima de restricción para NotI se generó dentro de esta región catenando dos fragmentos de PCR que contenían el sitio NotI en un lado por PCR. Los cebadores utilizados fueron los siguientes: KpnI-Plys1-F3 (GGGATAACAGGGTAATATGGTACCGAGCTGTTTGGACATGTTATG) y NotI-lys1-R3 (AACTACATCAGCGGCCGCTCTCAATTCCATTCTTTACGAG); y NotI-lys1-F4 (GGAATTGAGAGCGGCCGCTGATGTAGTTATGGTTTATGC) y EcoRI-lys1-R4 (CGTTGTAAAACGACGGCCAGTGAATTCGTCAGCTCCTTTTGAGACTG). La clonación del fragmento de PCR concatenado en el vector se realizó utilizando el kit In-Fusion HD (TaKaRa Bio).

La construcción del vector pCArg3 se llevó a cabo de manera similar. Los cebadores utilizados fueron los siguientes: KpnI-Parg3-F1 (GGGATAACAGGGTAATATACTAGTCGGTACCTGAGTTATCAATATAGTAACAC), NotI-arg3-R1 (AACGTTATTGCGGCCGCATCACCTACCCATGCAAC), NotI-arg3-F2 (GTAGGTGATGCGGCCGCAATAACGTTTTACATGATTTG) y EcoRI-arg3-R 2 (TGTAAAACGACGGC) CAGTGAATTCAGCATTTTTAACAGCAACC).

Las secuencias completas de pCLys1 y pCArg3 están depositadas en la base de datos DDBJ con los números de acceso LC745737 y LC745738, respectivamente. Estos plásmidos también se depositaron en el Centro de recursos genéticos de levadura de Japón con números de acceso para FYP5995 (pCLys1) y FYP5996 (pCArg3), por lo que están disponibles a pedido.

La construcción de vectores pCLys1 y pCArg3 que contenían GFP o mCherry se completó como se describe a continuación. Primero, el ORF de GFP o mCherry se clonó en pCLys1 y pCArg3. Los cebadores utilizados para la amplificación de GFP fueron los siguientes: NheI-GFP-F (TTATAGTCGCTTTGTTAAAGCTAGCCTCGAGCCCGGGATGAGTAAAGGAGAAGAAC) y BamHI-GFP-R (GCTTATTTAGAAGTGGCGCGCCGGATCCCGGGTTTGTATAGTTCATCCATGCC). pDUAL-GFH14 se utilizó como plantilla para PCR. Se amplificó un fragmento de GFP y luego se mezcló con pCLys1 o pCArg3 digerido con NheI y BamHI, y la mezcla se introdujo en células competentes de la cepa DH5α de E. coli. mCherry también se clonó en los mismos vectores de manera similar. Los cebadores utilizados para la amplificación de mCherry fueron SmaI-mC-F (TTATAGTCGCTTTGTTAAAGCTAGCCTCGAGATGGTGAGCAAGGG) y SmaI-mC-R (ATTTAGAAGTGGCGCGCCGGATCCCGAGCTCGTCCATGCCGCCG). El fragmento de mCherry amplificado se mezcló con los vectores digeridos con SmaI, seguido de la introducción en E. coli.

Los ORF que se fusionarán con GFP o mCherry se amplificaron mediante PCR de nuestra colección de clones de entrada de la levadura de fisión ORFeome15. Los cebadores utilizados para la amplificación fueron Ent-GFP-R (CCTTTACTCATCCCGGGCTCGAGGCTAGCAACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTA) para la fusión de GFP y Ent-mC-R2 (CGCCCTTGCTCACCATCTCGAGGCTAGCAATGCCAACTTTGTACAAGAAAGCTG) para la fusión de mCherry, en combinación con 221_pREY_F (ACTTATAGTCGCTTTGTTAAAGCTAGCGATATCAA) AAAAGCAGGCTCTCATATG) como pareja de los dos cebadores anteriores. Cada ORF amplificado se clonó en pCLys1 o pCArg3 que contenía GFP o mCherry mediante técnicas de reparación de brechas. La tecnología Gateway realizó la clonación de un ORF en el vector pDUAL que tiene YFP (pDUAL-YFH1c).

Se observó la fluorescencia de CFP, GFP, YFP y mCherry utilizando el microscopio de fluorescencia todo en uno BZ-X700 (KEYENCE). Se utilizó la lente objetivo CFI Plan Apo λ 100XH (Nikon). Las células se precultivaron en una placa YE o EMM2 que contenía tiamina y luego se sembraron en una placa EMM2 para inducir la expresión de proteínas fusionadas con proteínas fluorescentes impulsadas por el promotor nmt1.

Para permitir la integración cromosómica de cruce simple de tipo pDUAL, se necesitan cepas que tengan una mutación puntual en genes que codifican preferiblemente proteínas que funcionan en la ruta de biosíntesis de aminoácidos o nucleótidos. Hay varios mutantes auxotróficos de este tipo en la levadura de fisión. Sin embargo, los puntos de mutación de la mayoría de ellos no han sido identificados o no son adecuados para la complementación mediada por integración en vista de la posición. Por lo tanto, empleamos el sistema CRISPR/Cas9 para aislar dichos mutantes de la ruta de biosíntesis, de acuerdo con el método sin clonación informado recientemente por Zhang et al.12.

En el campo de la genética de levaduras de fisión, leu1, ade6 y ura4 han sido ampliamente utilizados como marcadores de selección16,17,18. El gen leu1 está ubicado en el brazo derecho del cromosoma 2, mientras que ade6 y ura4 están ubicados en el cromosoma 3. Seleccionamos loci de integración del cromosoma 1 para facilitar el manejo en el cruce genético entre nuevos marcadores y los tres loci anteriores. Como resultado, seleccionamos tres genes, lys1, arg3 e his119, como loci objetivo. Luego, diseñamos secuencias de ARN guiadas por un solo objetivo dirigidas al marco de lectura abierto de estos genes, utilizando el programa de predicción de sgRNA basado en la web CRISPR4P13. Entre las secuencias objetivo de sgRNA sugeridas por CRISPR4P, seleccionamos dos secuencias que están en la proximidad del codón de iniciación de cada ORF, porque un alelo en el que una mutación puntual se encuentra cerca del extremo 5' o 3' de un ORF es adecuado para la integración cromosómica de un solo cruce.

Introdujimos fragmentos de PCR que incluían secuencias objetivo de sgRNA y parte de ura4+ en un mutante ura4-D18 JY743 junto con pDB4280 digerido que contenía Cas9 y la parte 5' de ura4+12. Después de detectar transformantes Ura+, comprobamos la auxotrofia de aminoácidos de los transformantes. Similar a la situación observada para his1, se obtuvieron muchos transformantes Ura+ de la transformación de sgRNA #1 y #2. Sin embargo, solo unas pocas cepas mostraron auxotrofia de aminoácidos, lo que sugiere que estos sgRNA no fueron efectivos para atacar cada sitio. Lo mismo era cierto para los transformantes lys1 sgRNA #1. Por el contrario, en el caso de los transformantes lys1 sgRNA #2, muchos transformantes mostraron auxotrofia de aminoácidos, a pesar del menor número de transformantes en comparación con lys1 sgRNA #1. También se obtuvieron muchos transformantes auxotróficos a partir de dos sgRNA diferentes en el caso de arg3. Posteriormente, analizamos si y dónde se había producido una mutación en el gen objetivo mediante la secuenciación después de la amplificación por PCR de la región ORF. Como resultado, encontramos varias mutaciones en lys1 y arg3, pero no en his1 (Fig. 2a,b). También hubo varios mutantes auxotróficos de arginina que no tenían mutaciones en la región ORF de arg3, similar a la situación de his1. Esto puede deberse a efectos fuera del objetivo, como suele discutirse con el sistema CRISPR/Cas9. La mayoría de las mutaciones encontradas fueron deleciones o inserciones de un solo nucleótido, todas las cuales ocurrieron solo en la secuencia utilizada como objetivo de sgRNA.

Mutaciones de mutantes auxotróficos aislados en este estudio. Todas las mutaciones de (a) mutantes auxotróficos de lisina y (b) arginina se encontraron en las regiones objetivo de los sgRNA. Se muestran las secuencias de nucleótidos alrededor de las secuencias objetivo de sgRNA y las secuencias de aminoácidos se muestran debajo en el contexto del marco de lectura. El número del primer nucleótido de cada ORF se establece en 1. Las secuencias objetivo de sgRNA están subrayadas. Un nucleótido insertado se muestra en minúsculas. Un guión indica un nucleótido eliminado. Un asterisco indica un codón de terminación. Los cambios de aminoácidos a la secuencia predeterminada se indican en cursiva. (c) Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos del alelo arg3-R25. La secuencia de nucleótidos insertada se muestra en negrita. La secuencia de aminoácidos esperada de la proteína expresada a partir del alelo arg3-R25 se muestra debajo de la secuencia de nucleótidos.

Entre estos mutantes, el alelo arg3-R25 contiene un inserto de 262 nucleótidos (Fig. 2c). De acuerdo con este resultado, se obtuvo un producto más largo mediante la amplificación por PCR de este locus cuando se usó como molde el genoma de la cepa arg3-R25. Una búsqueda de BLASTN de esta secuencia reveló una coincidencia completa con una parte del genoma de Oncorhynchus tshawytscha, conocido como salmón chinook o salmón real. Este resultado sugiere fuertemente que la secuencia de 262 pb provino del ADN de esperma de salmón utilizado en la transformación de células de levadura, como se informó anteriormente20. Aunque el ADN de esperma de salmón que utilizamos se originó a partir de la especie de salmón Oncorhynchus keta, no pudimos encontrar ninguna secuencia que coincida con la secuencia de 262 pb en el conjunto de datos de O. keta disponible. Por lo tanto, hemos registrado esta secuencia en la base de datos DDBJ como parte del genoma de O. keta (número de acceso LC764838). Debido a que la inserción de un fragmento largo fue ventajosa para la integración cromosómica de un plásmido para evitar la complementación basada en la conversión de genes de una mutación21, seleccionamos el alelo arg3-R25 que sirve como objetivo para el vector de integración. En el caso de lys1, seleccionamos el alelo lys1-K24, que tiene una eliminación de adenina en el nucleótido 268 desde el comienzo del ORF de lys1, lo que da como resultado la generación de un codón de terminación justo aguas abajo de este sitio de mutación (Fig. 2a) .

Paralelamente al aislamiento de mutantes, diseñamos y construimos vectores para la integración cromosómica. Para la construcción de un vector llamado pCLys1 (Fig. 3a) que se puede integrar en el locus lys1, amplificamos la región genómica que contiene el promotor y la parte 5 'del ORF lys1 y reemplazamos la región leu1 del vector pDUAL con ellos. Se esperaba que el fragmento de lys1 clonado no fuera funcional, porque solo se clonó menos del 30 % del ORF de lys1. Este fragmento corto de lys1 se amplificó primero mediante PCR del genoma de tipo salvaje en dos partes y luego se fusionó con un sitio de reconocimiento NotI entre ellas. Por lo tanto, el gen parcial clonado podría dividirse en dos en la región ORF mediante digestión con NotI. El sitio NotI se creó aproximadamente 700 pb corriente abajo del punto de mutación del alelo lys1-K24. Si el vector pCLys1 linealizado por digestión NotI se integra en el locus lys1 que tiene la mutación lys1-K24, se generaría un gen lys1 funcional y se espera que los transformantes sean protótrofos de lisina (Fig. 4a).

Vectores desarrollados en este estudio. Estructura de pCLys1 (a) y pCArg3 (b). El marcador de selección consta del promotor y una parte del ORF de lys1 (pCLys1) o arg3 (pCArg3). Ambos vectores tienen el promotor nmt1 y el terminador ADH1 para la expresión génica heteróloga. Los sitios de clonación múltiple contienen secuencias de reconocimiento para NheI, XhoI, SmaI, BamHI y AscI. Una punta de flecha indica el sitio NotI para la linealización de los plásmidos. El esquema no está a escala.

Un diagrama conceptual que resume la integración de vectores en el genoma. Se muestra la integración de pCLys1 (a) y pCArg3 (b) en el cromosoma. Un asterisco indica el punto de mutación del alelo lys1-K24. Un cuadro con líneas diagonales indica un fragmento de 262 pb insertado dentro del ORF de arg3. La longitud de la columna vertebral del vector no está a escala.

También construimos el vector pCArg3 para la integración en el locus arg3 a través de un proceso similar (Fig. 3b). Al igual que en el caso de lys1, se esperaba que el fragmento arg3 parcial clonado en el vector pCArg3 no fuera funcional, porque el final del fragmento clonado todavía estaba aguas arriba de los puntos de mutación en los alelos obtenidos por la transformación arg3 sgRNA #1.

Posteriormente, examinamos si los vectores recientemente desarrollados podrían integrarse en los loci objetivo como se esperaba (Fig. 4a, b). Si las cepas que tienen los alelos lys1-K24 o arg3-R25 se transforman con pCLys1 o pCArg3, respectivamente, se obtendrían transformantes prototróficos. Linealizamos estos plásmidos con NotI antes de la transformación de las células de levadura. Como control, introdujimos los plásmidos directamente en los mutantes auxotróficos para examinar si se requiere linealización para la integración o no.

Después de la introducción de plásmidos o sus fragmentos digeridos en mutantes auxotróficos, aparecieron colonias grandes solo de las cepas transformadas con fragmentos digeridos tanto para lys1-K24 como para arg3-R25 (Fig. 5a). Aunque aparecieron colonias diminutas de las cepas transformadas con plásmidos no digeridos, no se agrandaron. Para ver si un gen dado podría expresarse utilizando los vectores desarrollados en este estudio, clonamos un ORF que codifica la proteína fluorescente verde (GFP) en pCLys1 y pCArg3 como representante. Integramos estos plásmidos en el cromosoma y recogimos algunos transformantes sin auxotrofia de aminoácidos. Cuando verificamos la fluorescencia de GFP después de rayar los transformantes en una placa EMM2, observamos señales que se dispersaron por las células con una ligera acumulación en el núcleo, lo que concuerda con la localización de proteínas GFP libres en la levadura de fisión (Fig. 5b)22. Para confirmar que los fragmentos digeridos se integraron con éxito en los loci objetivo, examinamos la estructura del genoma de los transformantes prototróficos mediante PCR de colonias. Este análisis demostró que todos los fragmentos derivados de pCLys1-GFP o pCArg3-GFP se integraron en cada locus objetivo como se esperaba solo cuando se detectó la fluorescencia de GFP (Fig. 5c).

Introducción de vectores recientemente desarrollados para la expresión de genes heterólogos. ( a ) Transformantes que surgieron después de la introducción de plásmidos linealizados desarrollados en este estudio. Las cepas AM595 (h– leu1-32 lys1-K24) y AM597 (h– leu1-32 arg3-R25) se transformaron con pCLys1 o pCArg3 con o sin pretratamiento con NotI y se sembraron en medio de selección SD sin lisina ni arginina. ( b ) Expresión de GFP introducida usando pCLys1 y pCArg3. Se detectaron los transformantes que surgieron después de la introducción de pCLys1-GFP y pCArg3-GFP linealizados en las cepas lys1-K24 o arg3-R25 y se controló la fluorescencia de GFP bajo microscopía de fluorescencia. (c) Confirmación de la integración cromosómica por PCR. La integración de pCLys1-GFP o pCArg3-GFP en el cromosoma se analizó mediante PCR usando cebadores indicados por puntas de flecha. Los transformantes #1 y #2 eran cepas en las que se observó fluorescencia de GFP, mientras que el transformante #3 no tenía fluorescencia. Se usó ADN lambda digerido con EcoT14I como marcador de tamaño. (d) Expresión simultánea de tres proteínas en una célula. Las células transformadas con pCLys1, pCArg3 y pDUAL que expresan uvi15-CFP, gpi16-YFP y gar2-mCherry, respectivamente, se observaron bajo microscopía de fluorescencia. Las barras de escala indican 10 μm.

Finalmente, examinamos si 3 genes podrían expresarse simultáneamente usando los vectores desarrollados en este estudio en combinación con el vector pDUAL desarrollado previamente. Para detectar su expresión, empleamos tres proteínas fluorescentes, CFP, YFP y mCherry. Identificamos varias proteínas que muestran una clara localización subcelular de nuestro archivo de datos de localización15. Seleccionamos la proteína nucleolar Gar2, la proteína ER Gpi16 y Uvi15, que se localiza en las puntas y los tabiques celulares, y clonamos sus ORF aguas arriba de CFP (pCLys1), YFP (pDUAL) y mCherry (pCArg3), respectivamente. Estos genes de fusión se expresaron bajo el control del promotor nmt1. Integramos estos plásmidos secuencialmente en el cromosoma de una cepa con los alelos arg3-R25, lys1-K24 y leu1-32, y recogimos algunos transformantes que no mostraban auxotrofia de aminoácidos. También intentamos transformar células con los tres fragmentos de plásmido. Sin embargo, no pudimos obtener ningún transformante en estas condiciones. Además, incluso cuando se usaron dos de los tres plásmidos, el número de transformantes obtenidos fue casi insignificante. Cuando verificamos la fluorescencia después de cultivar transformantes en una placa EMM2 para activar el promotor nmt1, observamos señales claras de todas las proteínas de fusión (Fig. 5d). Como se esperaba, Uvi15 mostró una localización constante en las puntas o tabiques celulares, mientras que Gpi16 se visualizó en estructuras membranosas similares a ER. Se observó una fuerte señal de la proteína nucleolar Gar2 en un compartimento específico del núcleo. Por lo tanto, demostramos que la introducción y expresión de tres transgenes diferentes es posible utilizando los vectores de integración recientemente desarrollados.

Desarrollamos dos conjuntos de sistemas de vector huésped de levadura de fisión que podrían usarse para la expresión heteróloga de genes de los loci lys1 o arg3. Usando estos vectores, demostramos que los vectores desarrollados se integraron correctamente en los loci objetivo, lo que resultó en la generación de transformantes protótrofos. Además, demostramos que GFP clonado en los vectores se expresó como se esperaba después de la integración cromosómica. Este tipo de integración da lugar a la generación de secuencias duplicadas a ambos lados del fragmento integrado1, que pueden servir como regiones de homología para una recombinación posterior que conduce a la eliminación del fragmento integrado, como se señaló anteriormente3. Para superar este problema, se desarrollaron vectores de integración que no producen regiones genómicas repetitivas mediante el empleo de recombinación cruzada doble3. Dichos reemplazos estables son adecuados para estudios a largo plazo, aunque esto se logra a expensas de una eficiencia de transformación relativamente baja. Por otro lado, los vectores de integración de cruce simple muestran una alta eficiencia de transformación similar a la obtenida por la introducción convencional de plásmidos, incluso permitiendo un pequeño riesgo de producir más recombinación. A partir de estas propiedades, los vectores cruzados únicos pueden ser adecuados para experimentos cualitativos y cuantitativos que requieren una alta eficiencia de transformación, como el cribado mediante bibliotecas de plásmidos. En la práctica, los transformantes obtenidos de los vectores desarrollados en este estudio, así como pDUAL, se pueden mantener en un medio que carece de los aminoácidos correspondientes, ejerciendo así fácilmente una presión selectiva sobre los transformantes.

Una preocupación importante asociada con la utilización del sistema CRISPR/Cas9 es la posibilidad de efectos fuera del objetivo, que implican la introducción de mutaciones no deseadas en ubicaciones genómicas distintas del objetivo previsto. En nuestro estudio, encontramos varias cepas auxotróficas que retuvieron los genes marcadores para el objetivo, posiblemente como resultado de efectos fuera del objetivo. Además, observamos una incorporación inesperada de un fragmento de ADN de salmón en el ORF de arg3. La integración inadvertida de ADN exógeno en el genoma del organismo huésped representa un problema potencial adicional al emplear el sistema CRISPR/Cas9. Estudios anteriores informaron la inserción de fragmentos de ADN de salmón en el genoma de la levadura de fisión20, y también se documentaron sucesos similares en otros organismos23, 24. Por lo tanto, aunque CRISPR/Cas9 ofrece un potencial sustancial para la edición del genoma, es imperativo considerar con diligencia -efectos objetivo e inserciones no deseadas. Aunque el proceso de obtención del alelo arg3-R25 fue inesperado, la inserción de ADN exógeno en la región 5' del ORF arg3 es una gran ventaja para este sistema experimental. Esto se debe a que la inserción ejerce una presión de selección sobre la región de recombinación aguas abajo del punto insertado, que es ideal para obtener integrantes adecuados que experimentan auxotrofia de arginina (Fig. 4b). Por lo tanto, seleccionamos arg3-R25 como el alelo más adecuado para apuntar a arg3 utilizando los vectores de la serie pCArg3.

En la investigación de la levadura de fisión, leu1+ y ura4+ se han utilizado principalmente como marcadores de selección1. El alelo leu1 más comúnmente utilizado del huésped es leu1-32, que tiene una mutación de sentido erróneo en el ORF4 de leu1. Por otro lado, el marcador ura4 más común utilizado en la cepa huésped es la deleción completa ura4-D1818. Por lo tanto, ura4-D18 no se puede utilizar para una recombinación cruzada única. Aunque se han desarrollado gradualmente vectores que emplean otros genes marcadores de selección, todavía tenemos opciones limitadas para la integración cromosómica de un transgén. Los vectores desarrollados en este estudio servirán como una opción valiosa para la expresión génica heteróloga del cromosoma en combinación con la mayoría de los marcadores informados anteriormente. En este contexto, estos vectores contribuirán considerablemente a los experimentos que requieran la expresión de múltiples transgenes.

Todos los datos generados o analizados durante este estudio se incluyen en este artículo publicado y sus archivos de información complementaria.

Reacción en cadena de la polimerasa

Marco de lectura abierto

ARN de guía única

Proteína fluorescente verde

Proteína fluorescente cian

Proteína fluorescente amarilla

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Artículo CAS PubMed Google Académico

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Este trabajo fue financiado en parte por JSPS KAKENHI Grant Numbers 15K14925 y 22K05361.

Grupo de Investigación de Genómica Química, Centro RIKEN para la Ciencia de Recursos Sostenibles, 2-1, Hirosawa, Wako, Saitama, 351-0198, Japón

Akihisa Matsuyama, Atsushi Hashimoto y Minoru Yoshida

Laboratorio de Microbiología, Departamento de Biotecnología, Escuela de Graduados en Ciencias Agrícolas y de la Vida, Universidad de Tokio, Tokio, 113-8657, Japón

Akihisa Matsuyama, Shinichi Nishimura y Minoru Yoshida

Instituto de Investigación Colaborativa para Microbiología Innovadora, Universidad de Tokio, Tokio, 113-8657, Japón

Shinichi Nishimura y Minoru Yoshida

Escuela de Graduados de Ciencias Integradas para la Vida, Universidad de Hiroshima, Higashi-Hiroshima, 739-8528, Japón

shinichi nishimura

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Este trabajo fue conceptualizado por AM y MY Todos los experimentos fueron realizados por AM y AHAM preparó el borrador original. SN y MI editado el manuscrito. Todos los autores revisaron el manuscrito.

Correspondencia a Akihisa Matsuyama.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Matsuyama, A., Hashimoto, A., Nishimura, S. et al. Un conjunto de vectores y cepas para la integración cromosómica en levaduras de fisión. Informe científico 13, 9295 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-36267-1

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Recibido: 03 febrero 2023

Aceptado: 31 de mayo de 2023

Publicado: 08 junio 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-36267-1

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