Caracterización molecular y bioquímica del arroz desarrollado a través de la integración convencional de nDart1

May 16, 2023

Scientific Reports volumen 13, Número de artículo: 8139 (2023) Citar este artículo

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Las mutaciones, las variaciones genéticas en las secuencias genómicas, juegan un papel importante en la biología molecular y la biotecnología. Durante la replicación o meiosis del ADN, una de las mutaciones son los transposones o genes saltadores. Un transposón autóctono nDart1-0 se introdujo con éxito en el cultivar índica local Basmati-370 a partir de una línea marcada con transposón, a saber, GR-7895 (genotipo japónica) a través de una técnica de reproducción convencional, retrocruzamiento sucesivo. Las plantas de poblaciones segregantes mostraron fenotipos variados y se etiquetaron como mutantes BM-37. El análisis Blast de los datos de la secuencia reveló que la proteína de unión a GTP, ubicada en el clon BAC OJ1781_H11 del cromosoma 5, contenía una inserción del transposón de ADN nDart1-0. El nDart1-0 tiene "A" en la posición 254 pb, mientras que los homólogos de nDart1 tienen "G", lo que distingue eficientemente a nDart1-0 de sus homólogos. El análisis histológico reveló que el cloroplasto de las células del mesófilo en BM-37 se interrumpió con una reducción en el tamaño de los gránulos de almidón y un mayor número de plastoglobuli osmofílicos, lo que resultó en una disminución del contenido de clorofila y carotenoides, parámetros de intercambio de gases (Pn, g, E, Ci ), y reducción del nivel de expresión de genes asociados con la biosíntesis de clorofila, la fotosíntesis y el desarrollo de cloroplastos. Junto con el aumento de la proteína GTP, el ácido salicílico (SA) y el ácido giberélico (GA) y los niveles de antioxidantes (SOD) y MDA aumentaron significativamente, mientras que las citoquininas (CK), ascorbato peroxidasa (APX), catalasa (CAT) , el contenido total de flavonoides (TFC) y el contenido total de fenoles (TPC) se redujeron significativamente en las plantas mutantes BM-37 en comparación con las plantas WT. Estos resultados respaldan la idea de que las proteínas de unión a GTP influyen en el proceso subyacente a la formación de cloroplastos. Por lo tanto, se prevé que para combatir las condiciones de estrés biótico o abiótico, el mutante marcado con nDart1-0 (BM-37) de Basmati-370 sería beneficioso.

Una planta herbácea anual semiacuática monocotiledónea, el arroz es un miembro de la familia Poaceae y pertenece al género Oryza1. El género Oryza tiene 22 taxones silvestres, de los cuales dos especies son de gran importancia para el consumo humano2. Estas especies son Oryza sativa L., generalmente conocida como arroz asiático, y Oryza glaberrima Steud, popularmente conocida como arroz africano. Varias clasificaciones dentro del género Oryza incluyen Oryza officinalis, Oryza ridelyi y Oryza rufipogon. De las 22 especies silvestres de Oryza, 15 son originarias de Asia y 7 del África subsahariana3. Estas especies son beneficiosas en los programas interespecíficos de mejoramiento de arroz porque las especies silvestres de Oryza tienen características particulares, incluida la tolerancia al estrés abiótico y biótico4,5. Más de la mitad de todos los seres humanos comen arroz, lo que lo convierte en el cultivo de cereales más importante6.

Además, la secuencia completa del genoma del arroz se ha secuenciado con gran fidelidad y se ha encontrado un número comparativamente alto de transposones, lo que lo convierte en un gran modelo para el estudio de los transposones7,8. Se encontró un transposón nDart1-0 (pyl-v) en un mutante de arroz virescente con hojas abigarradas de color amarillo claro de Taichung-65 (Oryza sativa japonica L.)9. En particular, los genotipos que contienen aDart1-27, un elemento de ADN autónomo activo, portan un gen de transposón, el elemento nDart1, que se transfieren activamente por todo el genoma10. Los elementos nDart1, que pertenecen a la superfamilia hAT, se eliminan de las ubicaciones cromosómicas insertadas y se transponen a otros sitios, a pesar de tener un alto grado de similitud de secuencia, nDart1-0 y los componentes no autónomos estrechamente comparables nDart1-1 a nDart1-12 mostrar diferentes frecuencias de transposición11. Los transposones activos se emplean con frecuencia para etiquetar genes y revelar sus funcionalidades12,13. Un método de etiquetado es una herramienta eficaz, porque los elementos nDart1 se transponen activamente en el genoma y tienen una propensión a integrarse en ubicaciones genómicas. Los elementos nDart1, especialmente transpuestos en ubicaciones en el promotor proximal del genoma, que se ubican 0,5 kb antes de los supuestos codones de iniciación14. Los métodos basados ​​en iPCR y los métodos de visualización de transposones (TD) también se crearon para ubicar eficientemente los sitios insertados de nDart1 en el genoma15,16.

Se han secuenciado los genomas completos de las subespecies de arroz japonica e indica, sin embargo, la investigación experimental sobre muchos genes funcionales en el genoma del arroz aún está en curso17. Examinar cuántos genes funcionan es ahora uno de los objetivos más difíciles. De acuerdo con las descripciones de ciertos genes específicos, numerosos componentes intermedios de los procesos de desarrollo, a saber, las proteínas involucradas en las vías de transducción de señales, todavía se conservan sustancialmente. La proteína G es una ilustración fantástica de estos llamados interruptores moleculares18. A través de actividades intrínsecas, estas proteínas experimentan cambios conformacionales provocados por la unión e hidrólisis de GTP14. Las proteínas de unión a GTP difieren en eucariotas y procariotas y se encuentran entre las proteínas más importantes para todas las especies19. GTPasas o proteínas G son otros nombres para estas proteínas. Es un interruptor molecular que está presente en todos los ámbitos de la vida. Es "activado" por la molécula de GTP y "inactivado" por la hidrólisis de la molécula de GTP a GDP. Regula varias funciones celulares, incluida la reorganización del citoesqueleto celular, la transducción de señales, la traducción, la regulación transcripcional, el tráfico de vesículas y el transporte de proteínas20,21. Los motivos G1, G2, G3, G4 y G5 están presentes en todas las proteínas G. Estas sustancias son necesarias para la hidrólisis de GTP, el cambio conformacional de GTP y la conversión de GDP/GTP. En la familia de proteínas G, el patrón G2 se mantiene con fuerza pero tiene poco impacto en la actividad de intercambio GDP/GTP22,23. El objetivo de este estudio fue introducir el transposón nDart1-0 en el cultivar de arroz Indica local de alto crecimiento "Basmati-370" para obtener un mutante a través de un enfoque de mejoramiento convencional y caracterizar el gen de la proteína de unión a GTP similar a ERA y sus efectos en la activación de fitohormonas, que pueden ser útiles para inducir la tolerancia al estrés biótico/abiótico en el arroz.

El material de reproducción requerido para el experimento actual se recolectó de dos fuentes diferentes; semilla del cultivar de arroz Indica, Basmati-370 del Instituto de Investigación del Arroz, Kala Shah Kaku, Punjab, Pakistán, y semilla de la línea japonica GR-7895 (que consiste en el transposón nDart1-0) del Instituto de Recursos Fitogenéticos, Centro Nacional de Investigación Agrícola (NARC) , Islamabad, Pakistán. Se ha confirmado que la recopilación de datos experimentales cumplió con las directrices y la legislación institucionales, nacionales e internacionales pertinentes con los permisos correspondientes del Instituto de Recursos Fitogenéticos, Centro Nacional de Investigación Agrícola (NARC), Islamabad, Pakistán. Los datos sobre los experimentos de búsqueda revelados con los estudios sobre Basmati-370 han demostrado que no lleva ninguno de los elementos aDart. El aDart es en realidad un portador del elemento de transposón nDart1-0. Con fines de estudio, se desarrollaron mutantes para el etiquetado de genes mediante la inserción del elemento transposón aDart. Se realizó un cruce entre Basmati-370 y GR-7895 para la inserción del elemento aDart en Basmati-370 del genotipo GR-7895. Las semillas maduras secas de ambas líneas se esterilizaron superficialmente para este propósito y se criaron en macetas en ambientes controlados. Para sincronizar la floración para el cruce, se cultivaron semillas de Basmati-370 a intervalos de una semana durante cuatro semanas sucesivas. El cruce se realizó manteniendo a Basmati-370 como progenitor hembra. Las semillas F1 se cultivaron en condiciones controladas y se retrocruzaron con plantas femeninas designadas de Basmati-370 para producir BC1F1 y continuar este retrocruzamiento para producir BC4F1 (Material complementario: Fig. S1). Las semillas cosechadas de BC4F1 se cultivaron y autopolinizaron para obtener BC4F2. Las semillas de BC4F2 se cosecharon y se cultivaron más en condiciones controladas para obtener una población segregante hasta BC4F4 de plantas para identificar los fenotipos anormales o albinos utilizados para el marcado de genes.

El ADN se extrajo de las plantas mutantes mediante el uso de un protocolo de aislamiento de ADN proporcionado por Doyle24. Luego, el ADN extraído se transfirió a un eppendorf; junto con la adición de 7 l de ARNasa, que se incubó a 37 ℃ durante 60 min. La calidad del ADN se verificó utilizando geles de agarosa al 2%, mientras que su cantidad se midió con Nanodrop. Luego, las muestras se diluyeron para obtener una concentración uniforme y estándar de ADN hasta 1 μl de cada muestra por 50 μl de dH2O. Luego se cuantificó el ADN aislado tomando una lectura de absorbancia a una longitud de onda de 260 nm manteniendo el uso de dH2O como muestra en blanco.

El ARN se aisló de hojas de plantas de arroz de Basmati-370 (WT) y BM-37 (mutante) a través del kit de reactivos de extracción de ARN total TRIeasyTM (Yeasen Biotechnology Co., Ltd. Shanghai, China) según las pautas del fabricante. La calidad del ARN se verificó utilizando geles de agarosa al 2%, mientras que su cantidad se midió con Nanodrop. El ADNc se sintetizó mediante una técnica qRT-PCR mejorada derivada del ARNm total25,26. Se realizó una PCR para amplificar el ADNc completo de GTP utilizando cebadores específicos. Los cebadores de oligonucleótidos (material complementario: Tabla S1) para la amplificación del ADNc de longitud completa de OJ1781_H11 se diseñaron en función de la secuencia notificada en el arroz (número de acceso AC120986). La secuencia amplificada por PCR fue clonada y secuenciada. La comparación de secuencias y el análisis de datos se realizaron utilizando blast con la base de datos NCBI.

Examinamos el nivel de expresión de nDart1-0 en plantas mutantes Basmati-370 (BM-37), incluidas plúmulas, hojas tercera y quinta en la etapa de plántulas, raíces, tallos, vaina, panículas jóvenes y hojas bandera en la etapa de espiga de plantas. Se realizaron pruebas cuantitativas de RT-PCR para medir la cantidad de expresión de nDart1. Un conjunto adicional de genes (PORA, CAO1, Cab1R, YGL1, CHLD, HEMA, PsbA, RNRS, RbcL, PsaA, RbcS, LhcpII, OsPoLP1, RNRL, FtsZ, Rpl21, RpoB, Rsp20, RpoA, OsRpoTp y Rps7 relacionados con la fotosíntesis , el desarrollo de cloroplastos y la biosíntesis de clorofila se examinaron para su nivel de expresión a través de qRT-PCR. Los cebadores diseñados para qRT-PCR se mencionan en la Tabla S2 (Material complementario). Las condiciones para las amplificaciones génicas se establecen en (Material complementario: Fig. S2).

El ADN genómico de hojas de plantas mutantes BM-37 se aisló según Dellaporta et al.27. Todos los mutantes se analizaron mediante el método n1-0SPiPCR (Material complementario; Archivo 1). Para la PCR se ajustaron las siguientes condiciones: una fase de activación a 95 °C por 30 s, desnaturalización con 35 ciclos a 60 ℃ por 30 s, recocido a 72 ℃ por 60 s y extensión a 72 ℃ por 10 min. Mediante el diseño de cebadores a través de la aplicación de software Primer_premier5 a partir del área flanqueante del gen alrededor del sitio de inserción del transposón, se amplificaron los fragmentos del transposón.

Las muestras de hojas de plantas Basmati-370 (WT) y mutantes (BM-37) desprovistas de venas se tomaron de plántulas seleccionadas al azar y se colocaron en glutaraldehído al 2,5% en tampón fosfato 0,1 M con pH 7,0 durante 5 h, luego se lavaron tres veces con tampón de fosfato (0,1 M, pH 7,0). Además, las muestras se posfijaron con OsO4 al 1 % durante 1 h y se lavaron tres veces con tampón de fosfato (0,1 M, pH 7,0) durante 15 min en cada lavado. Luego, las muestras se deshidrataron con series graduadas de etanol (30, 50, 70, 80, 90 y 100 %, respectivamente) y se rociaron con acetona concentrada durante 20 min y finalmente se incrustaron en medio de Spurr antes de cortarlas en secciones ultrafinas. Además, las muestras después de cortarlas en secciones ultrafinas se colocaron en las redes de cobre para observarlas con un microscopio electrónico de transmisión (JEOLTEM-1230EX).

Utilizando un espectrofotómetro haciendo pequeños ajustes en los métodos de Arnon y Wellburn28,29, se evaluaron el carotenoide (Car), la clorofila total y la clorofila (a y b). En pocas palabras, se recogieron muestras de 0,2 g de hojas de plántulas cultivadas bajo circunstancias controladas en la etapa de tres hojas y se homogeneizaron durante 18 h en la oscuridad en 5 ml de solución de etanol: agua: acetona (4: 1: 5). Se usó centrifugación para deshacerse de las partículas sobrantes. Se utilizó un espectrofotómetro UV5100 para evaluar los sobrenadantes. Además, se utilizó el sistema fotosintético portátil LI-6400 para cuantificar la tasa de transpiración (E), la concentración de CO2 intracelular (Ci), la conductancia estomática (g) y la tasa fotosintética neta (Pn).

Los contenidos de fenoles totales se calcularon mediante el método de Folin-Ciocalteu, actuando el ácido gálico como químico controlado30. Se utilizaron equivalentes de ácido gálico por gramo de peso fresco FW para indicar la cantidad de compuestos fenólicos totales. Al emplear la catequina como ingrediente de referencia, se utilizó la técnica del tricloruro de aluminio para medir la concentración de flavonoides31. (gE catequina.100 g1 FW) para expresar el contenido total de flavonoides. Siguiendo las recomendaciones del fabricante, utilizamos un kit ELISA de plantas para detectar el ácido salicílico endógeno (SA), ácido abscísico (ABA), ácido giberélico (GA) y citoquininas (CK). Para medir las concentraciones de SA, ABA, GA y CK en las muestras, se pulverizaron hojas en nitrógeno líquido. Los kits ELISA hormonales SA, ABA, GA y CK vienen con un conjunto de estándares de calibración. Luego se midieron los niveles de SA, ABA, GA y CK en las muestras ajustando la curva estándar y generando una tendencia comparable en las muestras.

Las muestras de hojas se homogeneizaron en tampón de fosfato de sodio (pH 7,8), se centrifugaron a 13.000 rpm durante 20 min a 4 °C. Luego, la actividad de superóxido dismutasa (SOD) se midió espectrofotométricamente como lo describen Zhang et al.32, a 560 nm mediante la evaluación de la capacidad de cada unidad para inhibir la reducción fotoquímica del 50% del cloruro de tetrazolio azul nitro (NBT). La actividad de peroxidasa (POD) se determinó según Zhou y Leul33, a 470 nm y los cambios relacionados con el guayacol se normalizaron con la constante de actividad (ε = 26,6 mm) y la actividad de catalasa (CAT) se determinó según Aebi34. La actividad APX se calculó en función de la disminución de la absorbancia a 290 nm según Nakano y Asada35 a medida que se oxidaba el ascorbato. Este estudio midió especies reactivas de oxígeno en tejidos vegetales, incluido el peróxido de hidrógeno (H2O2). El contenido de peróxido de hidrógeno se midió según lo descrito por Velikova et al.36. El contenido de malondialdehído (MDA) se determinó según Morales y Munné-Bosch,37. El contenido de fenoles totales se midió por el método de Folin Ciocalteu utilizando ácido gálico como compuesto de referencia30. El contenido de flavonoides se determinó por el método del tricloruro de aluminio utilizando la catequina como compuesto de referencia38.

Se informa el error estándar y la media de tres repeticiones para cada conjunto de datos. El análisis de los datos se llevó a cabo con el software estadístico Statistics 8.1. Los datos registrados se analizaron a través del análisis de varianza de una vía y la prueba LSD y la prueba de Tukey para determinar la significación por pares en p ˂ 0.05. Se utilizó Origin Pro (versión 8.5) para crear los gráficos.

Para estudiar la acción de los genes, la regulación y caracterización de los genes se ha convertido en la herramienta genética más importante en biotecnología e ingeniería genética debido a los enfoques genéticos inversos y directos. Para la evaluación del potencial genético y las variaciones en la población de plantas de cultivo, es necesario desarrollar mutantes mediante el uso de irradiaciones, productos químicos, transposones y mutaciones genéticas inducidas para etiquetar genes para llevar a cabo evaluaciones genómicas funcionales de genomas de especies, desde estrechos hasta más completos. rangos En nuestro estudio actual, hemos descrito un elemento transponible de ADN o genómico activo y no autónomo en el arroz, denominado transposón uno de arroz activo basado en ADN no autónomo (nDart1). El nDart1 es un elemento causal transponible del alelo con naturaleza mutable y virescente espontánea, la hoja amarilla pálida abigarrada o pyl-v, que causó amarillo pálido con rayas verde oscuro en las hojas de las plantas de arroz en etapas muy tempranas de plántulas, generalmente debido a la expresión del gen nDart1 en arroz. Hay múltiples elementos de transposón junto con sus múltiples sitios de inserción de genes, en los que se ha encontrado una línea de genotipo de planta de cultivo en cantidades limitadas debido a los requisitos reducidos para la identificación y caracterización de genes específicos que etiquetan un genoma de población para lograr la máxima saturación de elementos transponibles. . Para nuestro estudio actual, hemos seleccionado el gen nDart1 para producir mutantes de arroz, que se expresaron como hojas abigarradas de color amarillo pálido. El gen nDart1 se insertó en la variedad Basmit-370 mediante el método de retrocruzamiento convencional.

En nuestro estudio de investigación actual, hemos utilizado un transposón endógeno y disponible llamado nDart1 para desarrollar mutantes para marcar genes en el genotipo de arroz Basmati-370. Como no pudimos encontrar ningún nDart activo o elemento activo autónomo Dart en las variedades basmati locales, introdujimos aDart y nDart1-0 derivados de japonica en la variedad de arroz índica Basmati-370 a través del retrocruzamiento de genes mutantes. Se seleccionaron diferentes plantas de poblaciones segregantes que mostraron variación y se etiquetaron como mutantes (Fig. 1A) de la población BC4F4. A través del análisis genético, se supuso que este mutante estaba controlado por un sistema de transposones de dos componentes.

Mutantes inducidos por transposones de la población segregante. (A) Diferencia fenotípica entre plántulas albinas normales, revertidas y estables; (C, D) apariencia fenotípica de las terceras hojas en la etapa de plántula del mutante WT y BM-37; (D) plantas mutantes segregadas para el marcado de genes.

Durante el cultivo de plantas de arroz en el campo después de BC4F4, hubo hojas verdes normales en el WT y tipos variados de plantas de arroz albino en BM-37 (Fig. 1B, C), que se introdujo con nDart1/aDart1. Se postuló que las líneas que mostraban expresión génica tenían un alelo recesivo que tenía el homocigoto nDart1-0 así como un elemento autónomo activo como aDart1 con condiciones de alelo heterocigoto. Se encontró que la línea mutada producía descendencia albina estable (Fig. 1D). Los mutantes estables indicaron que no solo había alelos homocigóticos de GTP estables sino que también carecían de un elemento aDart1 con una proporción de 3:1 para F2. También se encontró que no había diferencia entre el WT y los mutantes en las semillas de arroz, pero la diferencia se encontró solo en la etapa de crecimiento de las plántulas, donde las semillas normales produjeron hojas y tallos verdes normales, mientras que las semillas mutadas produjeron brotes y hojas blancas. Los resultados indicaron la presencia de elementos aDart1 estables en fenotipos de plantas de arroz. Se encontró que las escisiones somáticas del alelo nDart1-0 dependiente de aDart1 produjeron una hoja con variaciones que se desarrollaron a lo largo del linaje celular o progenies de individuos mutados de la planta de arroz. Sin embargo, las plantas blancas mutadas o abigarradas pueden hacer crecer sus panículas con granos fértiles en condiciones extremas.

La frecuencia de mutación espontánea en condiciones de crecimiento natural es extremadamente baja. Los transposones son útiles para el etiquetado de genes y el análisis funcional para crear una variación natural, por lo que es útil explorar fuentes de transposones activos. Los fenotipos mutantes se marcaron en el campo y el ADN se aisló de las hojas fenotípicamente abigarradas de los mutantes. El ADN se sometió a digestiones de restricción y autoligado. La búsqueda de datos reveló que nDart1-0 tiene trece homólogos y una alta homología superior al 99 %. En la posición 254 pb, nDart1-0 tiene "A", mientras que los homólogos tienen "G", como se muestra en la Tabla S3 (Material complementario). El sitio "A" se usó de manera eficiente para distinguir nDart1-0 de sus homólogos.

Teniendo en cuenta que según esta técnica, el ADN se restringe con Alu I, se autoliga y nuevamente se somete a otra digestión de restricción con Bmt I y amplificación por iPCR utilizando cebadores específicos. La digestión por Alu I, restringe nDart1-0 en la posición 254 ya que lleva un sitio de restricción específico único debido a la sustitución de un par de bases "A" mientras que los homólogos llevan "G" en este sitio durante la autoligación, este fragmento digerido del nDart1-0 se liga con un fragmento del gen invadido por él (Fig. 2). La autoligación produce algunos fragmentos específicos que tienen una parte del nDart1-0 y el gen invadido por él junto con otros fragmentos. Nuevamente, la restricción de este ADN autoligado por Bmt I escinde el nDart1-0 ya que lleva el sitio Bmt I, como resultado, obtenemos algún fragmento del gen invadido flanqueado por nDart1-0. Estos fragmentos se amplificaron a través de iPCR utilizando los cebadores específicos diseñados para la región flanqueante de nDart1-0. Las dos rondas o ciclos de iPCR (como las amplificaciones de genes preselectivas y selectivas) se llevaron a cabo para confirmar los resultados. Durante el tipo selectivo de amplificación, la mejora y el enriquecimiento adicionales de los elementos de transposón o sus fragmentos específicos relacionados se lograron mediante el uso de productos de mezcla maestra de PCR disponibles como plantilla para llevar a cabo la amplificación del segundo elemento transponible con el tipo de cebador anidado, que reconoció específicamente Regiones de elementos transponibles altamente conservadas en el genoma. Los reordenamientos genómicos no específicos durante iPCR se descartan debido a los cebadores derivados de regiones específicas de nDart1-0. Por otro lado, los homólogos de nDart no llevan el sitio Alu I en la posición 254, no se digieren en esta posición y, en consecuencia, no se amplifican con cebadores específicos durante la iPCR (material complementario: Fig. S3A). Cuando el ADN restringido con Alu I y autoligado se usa como molde para iPCR, nDart1-0 y todos sus homólogos se amplifican, pero esta amplificación se restringe a nDart1-0 si el ADN autoligado se restringe nuevamente con Bmt I. Para la confirmación de los fragmentos obtenidos eran elementos transponibles o fragmentos de elementos transpuestos no detectados se amplificaron para estudiar las secuencias flanqueantes del elemento transposón, los fragmentos amplificados por PCR se secuenciaron y analizaron. Los patrones de amplificación para cada fragmento fueron similares, es decir, flanqueados por nDart1-0, excepto por la diferencia en los genes invadidos. Hasta ahora, hemos detectado 12 regiones génicas invadidas por nDart1-0 en el mutante BM-37 (Material complementario: Tabla S3). Se encontró que había un fragmento amplificado mutante que contenía secuencias flanqueantes de nDart1-0 que se derivaron debido a la inserción de nDart1-0 en las regiones del primer exón de un gen putativo (material complementario: Fig. S3B).

El transposón nDart1-0 y sus homólogos en arroz. Una secuencia de transposón nDart1-0 en arroz. Las flechas muestran la posición de los cebadores Las flechas y los sitios de restricción muestran las posiciones de los cebadores resaltados en rojo. Duplicación del sitio objetivo de TSD; Repeticiones invertidas terminales TIR.

Los resultados de nuestro estudio han sugerido que la inserción del elemento nDart1-0, así como su escisión en el gen putativo, fue como OJ1781_H11 en el cromosoma 5. El análisis de explosión de los datos de la secuencia reveló que el locus de la proteína de unión a GTP en el clon BAC OJ1781_H11 del cromosoma 5 se encontró que contenía una inserción del transposón de ADN nDart1-0. Este gen tiene una secuencia de nucleótidos de 2701 pb y 918 cDNA. El ORF codifica un polipéptido de 305 secuencias de aminoácidos y comprende 7 exones interrumpidos por 6 intrones. Durante el proceso de marcado de genes se encontraron cinco revertientes. Estos fenotipos revertientes se analizaron para averiguar la ausencia o presencia del transposón. El ADN se aisló de los fenotipos revertidos y las regiones insertadas en el transposón se amplificaron con los cebadores ya diseñados de las regiones flanqueantes del transposón. Los fragmentos amplificados (Fig. 3A, B) se clonaron y secuenciaron. El análisis de secuencia reveló que el transposón se movió desde el punto de inserción, dejando atrás las huellas.

Amplificación por PCR de mutantes de nDart1-0 y transcritos del gen de la proteína de unión a GTP en varios tejidos de Basmati 370. (A) Amplificación por PCR de mutantes de nDart1-0. Carril 1: Basmati 370, Carril 2: T-65, Carril 3: Nipponbare, Carril 4: Hoja blanquecina mutable, Carril 5: Hoja blanquecina estable-1, Carril 6: Hoja blanquecina estable-2, Carril 7: Hoja blanquecina estable-3; (B) transcripciones del gen de la proteína de unión a GTP en varios tejidos de Basmati 370. Carril 1: hoja de planta etiolada, Carril 2: raíz de planta etiloada, Carril 3: hoja de planta de 2 semanas, Carril 4: raíz de planta de 2 semanas , Carril 5: hoja de planta de 2 meses, Carril 6: raíz de planta de 2 meses, Carril 7: tallo de planta de 2 meses, Carril 8: meristemo de planta de 2 meses, Carril 9: gluma de planta de 2 meses, Carril 10: 2 meses de edad planta antera, Lane11-2Meses de edad planta estigma.

Para estudiar el patrón de expresión del transposón nDart1-0, se llevó a cabo qRT-PCR en varios niveles de tejido (hojas 3 y 5 en estado de plántula, plúmulas, vaina, brotes, raíces, panículas jóvenes y hojas bandera en estado de espiga) de mutante BM-37. La expresión más alta se encontró en la etapa de la tercera hoja de la plántula, en comparación con la quinta y la hoja bandera, en todos los tejidos analizados, lo que indica que las primeras hojas de la plántula tenían una expresión más alta que otros tejidos. Los tejidos, incluidos el tallo, la vaina y las raíces, expresaron un nivel de expresión significativamente más bajo que las hojas, mientras que las panículas y plúmulas jóvenes mostraron un nivel de expresión menor para BM-37 (Fig. 4). Los hallazgos sugirieron que nDart1-0 tiene un papel influyente en el desarrollo del cloroplasto de la hoja, particularmente durante la etapa temprana de plántula.

Niveles de transcripción para estudio de expresión de diferentes tejidos en mutante BM-37. plúmulas; 3er tercio de hojas en la etapa de plántula; 5to-quinto hojas en la etapa de plántula; YR-raíces jóvenes; Tallo, Vaina, FL-hojas bandera y YP-panícula joven. Todos los valores representan la media ± DE de cinco repeticiones. Letras diferentes sobre las barras de error indican las diferencias significativas entre tratamientos en p ≤ 0.05.

Usando TEM, se estudió la parte superior de las hojas en la etapa de macollamiento para examinar las alteraciones ultraestructurales en el cloroplasto de las plantas mutantes WT y BM-37. En contraste con los cloroplastos BM-37, que mostraron estructuras de láminas bien desarrolladas, las pilas de láminas de grana en las plantas WT eran escasas y escasamente pobladas. Esto sugiere que la mutación BM-37 tuvo un impacto significativo en la biogénesis. El resultado también demostró que los gránulos de almidón eran difíciles de ubicar en el cloroplasto del mutante BM-37 (Fig. 5A, B), aunque normalmente estaban presentes en el WT. En el mutante BM-37, había más plastoglóbulos (OP) osmofílicos que en el WT, lo que indica que el metabolismo de la clorofila estaba sustancialmente comprometido.

Imágenes TEM de cloroplastos en plantas de mutantes WT y BM-37 (A y B). G, montones de grana; OP, plastglóbulos osmofílicos; SG, gránulos de almidón.

En las fases de plántula y espiga de las plantas WT y BM-37, se examinaron los contenidos de carotenoides y clorofila para determinar el impacto del transposón nDart1-0 en el metabolismo de los pigmentos de la fotosíntesis. El contenido de clorofila (a, bya + b) y los niveles de carotenoides se redujeron drásticamente en BM-37 en la etapa de plántula en comparación con WT; sin embargo, el contenido de clorofila y los carotenoides mostraron resultados no significativos en la etapa de espiga en las plantas mutantes WT y BM-37 (Fig. 6A, B). Además, se midieron los parámetros de intercambio de gases para comparar las características fotosintéticas de las plantas mutantes WT y BM-37. En comparación con WT, el mutante BM-37 redujo drásticamente las tasas de actividad fotosintética (Pn), conductancia estomática (g), concentración de CO2 intercelular (Ci) y transpiración (E) (Fig. 6C-F).

Análisis de contenido de pigmentos de clorofila, contenido de carotenoides y parámetros fotosintéticos. (A) Contenido de clorofila y carotenoides en hojas en la etapa de plántula del mutante BM-37 y WT; (B) contenido de clorofila y carotenoides en hojas en la etapa de espiga del mutante BM-37 y WT (C) tasa fotosintética neta (Pn); (D) conductancia estomática (g); (E) concentración de CO2 intercelular (Ci); (F) tasa de transpiración (E). Todos los valores representan la media ± DE de cinco repeticiones. Según la prueba de Tukey, los asteriscos indican los niveles de significación estadística (*p < 0,05).

En plantas WT y plantas mutantes BM-37, los niveles de expresión de diferentes genes relacionados con el desarrollo de cloroplastos, la fotosíntesis y la biosíntesis de clorofila se evaluaron en la etapa de plántula. Los resultados mostraron que los genes asociados con la biosíntesis de clorofila; que comprende PORA, CHLD, YGLI, CAO1 y HEMA y los genes relacionados con la fotosíntesis como RbcS, Cab1R, PsaA, PsbA, RbcL y LhcpII39,40, se redujeron significativamente en las plantas mutantes pyl-v37 que en las plantas WT (Fig. 7A, B).

Análisis de expresión cuantitativa de genes relacionados con (A) biosíntesis de clorofila, (B) fotosíntesis y (C) desarrollo de cloroplastos en las plantas mutantes BM-37 y WT. El nivel de expresión de cada gen se analizó mediante qPCR.

También estudiamos el nivel de expresión de diferentes genes relacionados con el desarrollo del cloroplasto, incluidos RpoA, RpoB, OsRpoTp, Rps7, Rps20, RNRL, RNRS, OsPolP1, FtsZ y Rpl2141,42,43,44,45,46. Los niveles de expresión relativos de todos los genes asociados con el desarrollo del cloroplasto se redujeron significativamente en el mutante BM-37 en comparación con las plantas WT (Fig. 7C). Bajo estrés abiótico, es posible que la expresión aberrante de estos genes importantes haya causado el fenotipo mutante. Los hallazgos mostraron que la mutación BM-37 tuvo un impacto significativo en el metabolismo de la clorofila, la fotosíntesis y el desarrollo de cloroplastos en las células mutantes BM-37.

Las hojas mutantes BM-37 y WT en la etapa de plántula se utilizaron para evaluar los niveles de las fitohormonas relacionadas con el crecimiento más frecuentes, como SA, CK, GA y ABA en la planta. De acuerdo con los hallazgos, los niveles de CK fueron sustancialmente más bajos y los contenidos de GA y SA fueron significativamente más altos en el mutante BM-37 que en el WT, mientras que los niveles de ABA no difirieron significativamente de los del WT (Fig. 8A-D). Según los hallazgos, el mutante BM-37 mostró una señalización hormonal eficiente para la formación de cloroplastos.

Fitohormonas endógenas, antioxidantes enzimáticos, antioxidantes de bajo peso molecular (LMWA) y especies reactivas de oxígeno (ROS) en BM-37 mutante y WT. (A) CK-citoquininas; (B) ABA-ácido abscísico; (C) SA-ácido salicílico y (D) GA-ácido giberélico; (E) SOD-superóxido dismutasa; (G) APX-ascorbato peroxidasa; (I) POD-peroxidasa; (K) CAT-catalasa; (F) contenido de flavonoides totales de TFC; (H) TPC-contenido de fenoles totales; (J) H2O2-peróxido de hidrógeno y (L) contenido de MDA-malonaldehído. Todos los valores son la media ± DE de tres repeticiones biológicas. * p < 0,05 por la prueba de Tukey.

También evaluamos ROS, como la producción de H2O2 y el contenido de MDA, y sus antioxidantes secuestrantes, como los antioxidantes de bajo peso molecular y los antioxidantes enzimáticos, para estudiar las actividades de los antioxidantes para compararlos entre WT y el mutante BM-37 (Fig. 8E– L). Los antioxidantes enzimáticos como CAT y APX, que son significativamente más bajos en las hojas de BM-37 mientras que SOD es considerablemente más alto en las hojas de WT, podrían eliminar los compuestos oxidativos (Fig. 8E, G, K). Los niveles de MDA aumentaron sustancialmente en las plantas BM-37 que en las plantas WT (Fig. 8L), lo que muestra que las hojas mutantes tenían más daño oxidativo. Los resultados también mostraron que no hay cambios apreciables entre los valores de BM-37 y WT para H2O2 y POD (Fig. 8I, J). Los resultados también mostraron que los valores de TFC y TPC también se redujeron significativamente en las hojas mutantes BM-37 en comparación con las hojas WT (Fig. 8F, H). El estudio encontró que BM-37 tenía una defensa antioxidante inadecuada porque era menos efectivo que el WT para eliminar las ROS generadas por cloroplastos defectuosos.

Para el marcado de genes, la mutagénesis de inserción por T-DNA, Tos17 o transposones de maíz, Ac/Ds y En/dSpm es muy útil, pero la principal desventaja es la presencia frecuente de variación somaclonal. La frecuencia de marcaje génico por retrotransposón endógeno Tos17 es muy baja47,48. Las mutaciones mediante la inserción de TE de ADN endógeno son deseables para producir recursos mutantes etiquetados con transposones. La única desventaja con un TE de ADN endógeno es generar mutantes estables inducidos por huellas. En este caso, es difícil identificar el gen mutante. Previamente se realizaron esfuerzos para reactivar mPing, un miembro de la familia MITE similar a un turista, en el genoma del arroz a través de técnicas de cultivo de tejidos49,50 e irradiaciones de rayos gamma51,52,53. La inserción de mPing indujo duplicaciones del sitio objetivo (TSD) de TTA o TAA, y mPing generalmente tiende a insertarse en la región no codificante o intrón, por lo que mPing no se consideró una buena herramienta de etiquetado de transposones. Por otro lado, los TE de ADN, nDat1-0, fueron descubiertos en arroz9. Estructuralmente, nDart1-0 es un transposón de ADN activo no autónomo con un tamaño pequeño (607 pb) y GC altamente rico (alrededor del 72%), y tiende a transponerse en regiones genéticas, lleva un segmento perfecto de 19 pb de terminal repeticiones invertidas (TIR), que por lo general tiene duplicaciones de sitios específicos de GC de 8 pb de alto y pertenece a la súper familia hAT54,55. También se encontró que el nDart1-0 insertado en OsClpP5 invadía otros dos genes, lo que indica su alta eficiencia para el etiquetado de genes9. La búsqueda explosiva reveló que Nipponbare y la variedad indica 9311 tienen 13 y 7 homólogos de nDart1, respectivamente. La utilización eficiente de nDart1-0 para el marcado de genes generalmente depende de la presencia o ocurrencia de aDart en esa variedad de arroz. Se observó que Nipponbare lleva 63 candidatos del elemento autónomo aDart56. Estas características específicas distinguen a nDart1-0 de la mayoría de los últimos y anteriores estudios y descubrimientos de elementos transponibles no autónomos en el ADN.

Los elementos transponibles causaron jaspeado o plantas albinas, cuando estos elementos se expresaron en variedades de arroz57. En maíz y Antirrhinum majus, se han informado genes de etiquetado de transposones, que se han aislado con éxito junto con diferentes rangos de genes o elementos transponibles58,59,60. Por lo tanto, desarrollamos una estrategia para etiquetar genes mutados por la invasión de nDart1-0. La estrategia recientemente desarrollada que utiliza iPCR (n1-0SPiPCR) es útil para nuestro sistema de etiquetado específico de nDart1-0. Mediante este sistema, los elementos de los transposones suelen etiquetarse a través de una PCR inversa por restricción-ligación-mediada por restricción, que parte de secuencias específicas de transposones y amplifica la parte de las secuencias flanqueantes a un sitio específico para la restricción. Los productos de PCR resultantes pueden usarse para clonar, analizar o secuenciar61,62,63. Los estudios anteriores elaboraron que tanto aDart como nDart1-0 se han encontrado herramientas útiles para el etiquetado de genes en especies de arroz japonica e indica. Hemos encontrado que la utilización de un enfoque sistemático y computacional bien establecido para el aislamiento del elemento transposón activo nDart1-0 del genoma de la célula huésped puede ayudar a comprender el patrón de herencia de los elementos transponibles en el arroz64,65. Sin embargo, esta técnica no solo es el método rápido para detectar el nDart1-0, sino que también tiene su uso en el etiquetado de genes para varios genes en el genoma del arroz.

Las plantas mutantes albinas o abigarradas proporcionan información importante y valiosa sobre el crecimiento y desarrollo de plástidos; su análisis genético ha sido difícil debido a sus efectos fenotípicos más letales66. A partir del presente estudio, el alelo silenciado se identificó con éxito utilizando el procedimiento recientemente desarrollado denominado nDart1-0-iPCR. Se ha encontrado a partir del etiquetado de la línea nDart1/aDart1 que contenía el elemento transponible más frecuente y repetido nDart1-0 mientras que la otra línea tenía elementos transponibles nDart167,68. Se ha encontrado que los elementos transponibles de nDart1 mostraron su comportamiento para integrarse dentro de las regiones promotoras de los genes69. También se descubrió que la inserción de nDart1-0 es una causa de mutación en el gen GTP a 13 pb aguas abajo del codón ATG de iniciación del gen GTP. Hubo una mutación de cambio de marco en el gen GTP debido a la inserción de nDart1-0 aguas abajo de los sitios de iniciación transcripcional del gen GTP. Los resultados de experimentos de investigación anteriores también han revelado que la inserción de nDart1 en los sitios de iniciación de la transcripción causó efectos en los niveles de expresión en los sitios de genes aguas abajo. El OsClp5 ha mostrado sus efectos que se interrumpieron debido a la inserción en la posición 5'-UTR del transposón nDart1 en pyl-v mutant70. Se encontró que la línea de arroz mutante exhibió una inflorescencia aumentada y mejorada, lo que indica que la inserción de nDart1-0 puede causar un nivel de expresión génica regulado al alza desde sitios posteriores de nombres de genes como Aberrant Panicle Organization1 en arroz71,72,73.

A partir de varios estudios de investigación, la proteína GTP se requiere en cantidades más altas para la biogénesis del cloroplasto, mientras que en cantidades más bajas para la biogénesis del etioplasto. Se ha encontrado que la eficiencia de traducción de GTP se activa a partir del etioplasto durante el desarrollo del cloroplasto. La división celular de los plástidos ocurrió principalmente durante P0 hasta las etapas de crecimiento muy tempranas de P4, mientras que la activación del aparato fotosintético se ha encontrado durante la etapa de crecimiento P4 de los gravámenes de arroz74,75,76. Nuestro estudio actual sugiere que la proteína GTP funciona durante el desarrollo de las membranas tilacoides de los cloroplastos debido a un sistema genético bien establecido de plástidos. Mientras que en los tejidos vegetales no verdes, también se ha encontrado que la abundancia y acumulación de la proteína GTP durante el desarrollo del cloroplasto estaba regulada a nivel postranscripcional.

El mutante BM-37, con la inserción de nDart1-0, tiene un contenido más bajo de carotenoide y clorofila en la etapa de plántula y una reducción importante en el pigmento probablemente afectaría el desarrollo del cloroplasto y, en última instancia, el proceso de fotosíntesis (Fig. 6A). La microscopía electrónica de transmisión confirmó cambios ultraestructurales en BM-37 debido a la mutación del gen nDart1-0 (Fig. 5). Más cantidad de plastoglóbulos observados en BM-37 que es consistente con la investigación previa de que la cantidad de plastoglóbulos aumentó cuando los mutantes tienen un defecto en la biogénesis de la membrana tilacoidal y su formación previene el daño oxidativo de los tilacoides77. En BM-37, el cloroplasto contenía gránulos de almidón más pequeños, lo que indica que se alteró la formación de almidón, lo que afecta el suministro de energía para el desarrollo del cloroplasto78. Además, la reducción en el contenido de clorofila del mutante BM-37 ha disminuido los parámetros fotosintéticos clave, como la tasa fotosintética neta, la conductancia estomática, la tasa de transpiración y la concentración de CO2 intercelular (Fig. 6C-F) que también se observó en el mutante donde el gas los parámetros de intercambio (Pn, Tr, g y Ci) disminuyeron con la reducción del contenido de clorofila79. Además, el nivel de transcripción más bajo de genes involucrados en el desarrollo de cloroplastos, la biosíntesis de clorofila y la fotosíntesis del mutante BM-37 (Fig. 7A-C) han proporcionado la evidencia de que la mutación en nDart1-0 ha alterado la señalización retrógrada de plástido a núcleo que es consistente con el hallazgo anterior de que la señalización retrógrada del cloroplasto también se interrumpió en el mutante spc1 de Arabidopsis80. En conjunto, estos resultados indicaron que la mutación en BM-37 se asoció con el desarrollo de cloroplastos y la eficiencia fotosintética.

Las plantas mutantes BM-37 en la etapa de plántula conducen a una reducción sustancial de los contenidos de clorofila y carotenoides, lo que da como resultado un desarrollo de cloroplasto deficiente que podría acumular una mayor cantidad de ROS. Los carotenoides brindan protección contra el daño fotooxidativo mediante la desintoxicación del exceso de radicales libres y especies reactivas de oxígeno (ROS)81. Por ejemplo, la alteración de la biogénesis del cloroplasto en la hoja de arroz zebra225 abigarrada, así como la mutación en ACD2 que codifica la catabolito reductasa de la clorofila roja82, dieron como resultado una acumulación excesiva de ROS. Las plantas producen enzimas antioxidantes para desintoxicar ROS, como SOD para hacer frente a los superóxidos, mientras que CAT, POD y APX eliminan H2O2. Además, se ha informado que los antioxidantes no enzimáticos pueden oxidarse a monodehidroascorbato en niveles más altos de ROS83. En consecuencia, nuestros resultados mostraron contenidos más bajos de antioxidantes no enzimáticos (Fig. 8F, H) en plantas mutantes BM-37. Por lo tanto, los resultados infieren que el mal funcionamiento de las enzimas depuradoras de ROS y la acumulación de H2O2 y MDA debido al desarrollo deficiente del cloroplasto ha introducido el color amarillo de la hoja en el mutante BM-37 en la etapa de plántula.

Bajo diversos estreses abióticos, las especies reactivas de oxígeno (ROS) y la peroxidación lipídica producida en las plantas de cultivo causaron daños en las células y provocaron la muerte de las plantas de cultivo. La reducción en el crecimiento resulta de anomalías celulares y subcelulares en las células vegetales84,85,86. Cada célula vegetal de cultivo tiene la capacidad de producir antioxidantes (SOD, POD, CAT y APX) para inducir el mecanismo de autodefensa en la célula, especialmente para el cloroplasto y la mitocondria87,88. Las especies reactivas de oxígeno (H2O2) afectan principalmente a las membranas de los cloroplastos y las mitocondrias, lo que finalmente causa la muerte celular. La producción de peroxidasa (POD), catalasa (CAT), guayacol peroxidasa (GPOD), peróxido de hidrógeno (H2O2), superóxido dismutasa (SOD), lipoxigenasa (LOX), catalasa (CAT), ascorbato peroxidasa (APOD) y glutatión-S -transferasa (GST), glutatión, prolina, ácido ascórbico, etc. son compuestos bioorgánicos producidos en las células89,90. Las proteínas GTP proporcionan un entorno para que estos antioxidantes funcionen en diversas condiciones. Las proteínas GTP se localizan en las células donde hay necesidad de combatir condiciones de estrés. La exploración de varios estudios sobre la regulación hormonal de las plantas y la señalización de la proteína G revela varias similitudes intrigantes en sus roles funcionales. Además, los mutantes de proteína G de Arabidopsis muestran fenotipos alterados en respuesta a diferentes hormonas vegetales91,92, y los datos del transcriptoma revelan un cambio significativo en la expresión de genes de proteína G bajo diferentes tratamientos hormonales93. A partir de estos estudios, se concluye que el transposón nDart1 -0 es un sistema útil para desarrollar mutantes para el análisis de genes funcionales, y n1-0 SPI PCR es una herramienta poderosa para analizar mutantes desarrollados por la inserción del transposón nDart1-0. Las transcripciones de la proteína de unión a GTP se observaron en varios tejidos de plantas, normalmente en las primeras etapas de las plantas. La proteína de unión a GTP similar a la era es un nuevo miembro de una vieja familia, y es vital para la biosíntesis de cloroplastos y la supervivencia de las plantas.

Estos estudios concluyen que el transposón nDart1-0 es un sistema útil para desarrollar mutantes para el análisis funcional de genes y n1-0 SPI PCR es una herramienta poderosa para analizar mutantes desarrollados por la inserción del transposón nDart1-0. Las transcripciones de la proteína de unión a GTP se observaron en varios tejidos vegetales, generalmente en las primeras etapas de las plantas. Era-como la proteína de unión a GTP es un nuevo miembro de una familia antigua, y es vital para la biosíntesis de cloroplastos y la supervivencia de las plantas. El protocolo descrito puede ser útil como método potencial para identificar elementos transponibles de otros organismos, incluidas plantas como el maíz. Sin embargo, podría haberse esperado que esta técnica describiera no solo el método rápido para detectar el nDart1-0, sino también su utilización en el etiquetado de genes para varios genes en el genoma del arroz.

Todos los datos generados o analizados se han proporcionado en el manuscrito y archivos complementarios.

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Este trabajo fue apoyado por la Oficina de Ciencia y Tecnología de la provincia de Zhejiang, China (proyecto n.° 2021C02063-6) y respaldado por la Oficina de Ciencias del DOE, Oficina de Investigación Biológica y Ambiental (BER), Estados Unidos, subvenciones Nos. DE- SC0006634 y DE-SC0012379

Departamento de Agronomía, Universidad de Zhejiang, Hangzhou, 310058, Zhejiang, China

Sanaullah Jalil, Asad Ullah Khan, Muhammad Mudassir Nazir, Sharafat Ali y Xiaoli Jin

Instituto de Ciencias de Cultivos, Centro Nacional de Investigación Agrícola, Islamabad, 44000, Pakistán

Sanaullah Jalil

Departamento de Fitomejoramiento y Genética, Facultad de Ciencias Agrícolas, Universidad de Punjab, Lahore, 54590, Pakistán

Qurban Ali y Muhammad Arshad Javed

Departamento de Ciencias Hortícolas, Facultad de Agricultura y Medio Ambiente, Universidad Islamia de Bahawalpur, Bahawalpur, 63100, Pakistán

faisal zulfiqar

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SJ, conceptualización, investigación, redacción del borrador original; QA, conceptualización, investigación; AUK, FZ, SA, MAJ y MMN, revisión, edición. análisis formal; XJ, supervisando, escribiendo, revisando y editando. Todos los autores revisaron el manuscrito.

Correspondencia a Xiaoli Jin.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Jalil, S., Ali, Q., Khan, AU et al. Caracterización molecular y bioquímica del arroz desarrollado a través de la integración convencional del gen del transposón nDart1-0. Informe científico 13, 8139 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-35095-7

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Recibido: 21 julio 2022

Aceptado: 12 de mayo de 2023

Publicado: 19 mayo 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-35095-7

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