Beta

Apr 12, 2023

Communications Medicine volumen 3, Número de artículo: 75 (2023) Citar este artículo

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Desde el comienzo de la pandemia de COVID-19, han surgido varias variantes de preocupación (VOC) para las cuales existe evidencia de un aumento en la transmisibilidad, enfermedad más grave y/o efectividad reducida de la vacuna. Se requieren estrategias efectivas de vacuna contra el COVID-19 para lograr una amplia inmunidad protectora contra los COV actuales y futuros.

Realizamos estudios de inmunogenicidad y desafío en macacos y hámsteres utilizando una formulación de vacuna recombinante bivalente que contiene los trímeros Spike estabilizados por prefusión de SARS-CoV-2 de las cepas ancestrales D614 y Beta variante con adyuvante AS03 (CoV2 preS dTM-AS03) en un primario escenario de inmunización.

Mostramos que una inmunización primaria con el bivalente CoV2 preS dTM-AS03 provoca respuestas de anticuerpos neutralizantes más amplias y duraderas (1 año) contra COV, incluidos Omicron BA.1 y BA.4/5, y SARS-CoV-1 en comparación con el ancestral D614 o vacunas monovalentes variante Beta en primates no humanos no expuestos. Además, la formulación bivalente confiere protección contra el desafío viral con la cepa prototipo D614G del SARS-CoV-2, así como las cepas variantes Alfa y Beta en hámsters.

Nuestros hallazgos demuestran el potencial de una formulación bivalente de CoV2 preS dTM-AS03 que contiene beta para proporcionar una inmunogenicidad amplia y duradera, así como protección contra COV en poblaciones ingenuas.

El SARS-CoV-2 ha cambiado con el tiempo, dando como resultado diferentes formas del virus llamadas variantes. Estas variantes comprometen la protección que ofrecen las vacunas contra el COVID-19, que desencadenan una respuesta inmune contra la proteína viral Spike que permite que el virus se adhiera e infecte a las células humanas, ya que sus proteínas de punta son diferentes. Aquí, desarrollamos y probamos una vacuna que contiene dos proteínas Spike diferentes, una de la cepa original de Wuhan y otra de la variante Beta. En macacos, la vacuna conduce a la producción de anticuerpos capaces de evitar que todas las variantes probadas infecten células humanas, incluido Omicron, con niveles estables durante un año. En los hámsteres, la vacuna protegió contra la infección por el virus ancestral y las variantes Alfa y Beta. Nuestros hallazgos tienen implicaciones importantes para el control de la vacuna de las variantes preocupantes del SARS-CoV-2 existentes y futuras.

El síndrome respiratorio agudo severo coronavirus 2 (SARS-CoV-2), responsable de la enfermedad por coronavirus (COVID-19), surgió a fines de 2019. Durante los primeros seis meses de la pandemia, una variante con una sola mutación en el antígeno Spike (D614G ), reemplazó la cepa Wuhan ancestral circulante (D614). Sin embargo, la estabilidad genética relativa terminó después del primer año cuando las variantes de preocupación (VOC) que mostraban múltiples mutaciones en el antígeno Spike, desplazaron sucesivamente a la cepa anterior y causaron múltiples oleadas de infecciones en todo el mundo. Se han identificado varios VOC (Alpha, Beta, Gamma, Delta y Omicron BA.1), junto con subvariantes muy diversas de Omicron, algunas de las cuales han sido clasificadas como nuevos VOC por el Centro Europeo para la Prevención y el Control de Enfermedades (BA. 4 y BA.5)1. La evolución del SARS-CoV-2 continúa a una velocidad más alta de lo previsto anteriormente y ahora está impulsada principalmente por el escape inmunitario, como lo demuestra la alta incidencia de la enfermedad sintomática de Omicron en individuos vacunados2. Aunque se han aprobado múltiples vacunas para su uso en un tiempo récord, todas las vacunas autorizadas se diseñaron originalmente para atacar la cepa ancestral D6143,4.

Ahora está bien establecido que el SARS-CoV-2 es endémico, con una gravedad impredecible5. Por lo tanto, existe una necesidad urgente no satisfecha de vacunas COVID-19 optimizadas a prueba de variantes para brindar una protección amplia y duradera contra las variantes existentes y futuras.

Debido a la continua y rápida sustitución de BA.1 por otros sublinajes de Omicron (BA.2, BA.2.12.1, BA.4, BA.5, BQ.1, BQ.1.1...) que muestra un escape inmune similar al superior y tasas de transmisión que BA.16,7,8,9, las estrategias de vacunas actuales que persiguen cada nueva variante deben reevaluarse, tanto para las dosis de refuerzo como para la inmunización primaria10,11. De hecho, las estrategias de vacunas de próxima generación deben abordar la protección eficiente para la población no vacunada y sin experiencia previa, como los niños pequeños en riesgo de futuros COV circulantes12.

Recientemente demostramos que los trímeros de Spike estabilizados por prefusión solubles (CoV2 preS dTM) basados ​​en la secuencia D614 formulada con el adyuvante AS03 obtuvieron un perfil de seguridad favorable y una alta inmunogenicidad contra la cepa ancestral en adultos sin tratamiento previo13. Además, demostramos que, en macacos cebados, una dosis de refuerzo de CoV2 preS dTM-AS03 (D614 o Beta) mejoró los anticuerpos neutralizantes (nAbs) contra el virus ancestral y extendió la neutralización a múltiples VOC (Alpha, Beta, Gamma, Delta y Omicron) y SARS-CoV-114,15. Los datos preliminares de dos ensayos clínicos que evaluaron CoV2 preS dTM-AS03 como refuerzo en individuos vacunados contra el COVID-19 confirmaron estos resultados y sugirieron además la superioridad de las formulaciones de vacunas beta monovalentes en comparación con las vacunas de subunidades o ARNm monovalente D61416,17.

Aquí, informamos la inmunogenicidad y la protección de una formulación de vacuna recombinante bivalente que contiene los trímeros Spike estabilizados por prefusión de las cepas ancestrales D614 y Beta (B.1.351) en un entorno de inmunización primaria en macacos y hámsteres. La secuencia Beta Spike se seleccionó en función de su importante escape inmunitario al prototipo de anticuerpos neutralizantes inducidos por la vacuna atribuidos principalmente a las tres mutaciones RBD (K417N, E484K y Y501N)18,19,20,21. Se vacunaron macacos cynomolgus y hámsters sin tratamiento previo con vacunas candidatas monovalentes (D614 o Beta) o bivalentes (D614 + Beta) CoV2 preS dTM-AS03 para evaluar las respuestas de anticuerpos neutralizantes contra cepas homólogas a la vacuna, un amplio panel de VOC que incluye subvariantes de Omicron y SARS -CoV-1, así como células B de memoria y durabilidad de las respuestas de anticuerpos neutralizantes. La protección conferida por las formulaciones de vacunas que contienen Beta se evaluó en hámsters vacunados después de un desafío con las variantes prototipo D614G, Alfa o Beta.

Nuestros datos muestran que la inmunización primaria con la vacuna candidata ancestral/Beta bivalente CoV2 preS dTM-AS03 provoca respuestas de anticuerpos neutralizantes duraderas por hasta 1 año, con la cobertura más amplia contra SARS-CoV-2 COV, incluidos Omicron BA.1 y BA.4 /5, así como contra el SARS-CoV-1 en primates no humanos (NHP) ingenuos, y confiere protección contra el desafío de la variante prototipo D614G, Alpha o Beta en hámsteres.

Las vacunas candidatas CoV2 preS dTM D614 o Beta con adyuvante AS03 y formuladas como vacunas monovalentes o bivalentes se describieron previamente en las refs. 14,22.

En resumen, los candidatos a la vacuna CoV2 preS dTM consisten en una proteína S recombinante trimérica de prefusión estabilizada SARS-CoV-2. El CoV2 preS dTM (D614) y Beta fueron diseñados en base a las secuencias Wuhan YP_009724390.1 y B.1.351 (GISAID Accession EPI_ISL_1048524), respectivamente, con dos prolinas en el dominio S2, mutación del sitio de clivaje de furina y reemplazo de la transmembrana región por el dominio de trimerización de foldon T4. El CoV2 preS dTM D614 o Beta se produjeron utilizando una tecnología de cultivo celular patentada de Sanofi basada en el sistema de expresión de células de insectos-baculovirus. Los CoV2 preS dTM D614 o Beta están formulados con el adyuvante AS03 de GSK.

Las reservas virales de SARS-CoV-2 utilizadas para el desafío se prepararon en Bioqual a partir de semillas obtenidas de Biodefense and Emerging Infections Research Resources Repository (BEI Resources). El stock de SARS-CoV-2 USA/NY-PV08449/2020 (D614G) se derivó del stock de semillas BEI NR-53515 y se le asignó el número de lote 091620-230. El título original es 9,8 × 104 TCID50/mL (en VeroE6) y 5 × 107 TCID50/mL en Vero TMPRSS2. El stock de la variante alfa de SARS-CoV-2 (B.1.1.7) se derivó del stock de semillas BEI NR-54011 y se le asignó el número de lote 012921-1230. El título original es 1,58 × 107TCID50/mL y 1,38 × 106 PFU/mL en Vero TMPRSS2. El stock de la variante beta del SARS-CoV-2 (B.1.351) se derivó del stock de semillas BEI NR-54974 y se le asignó el número de lote 030621-750. El título de reserva se determinó en células VeroE6 y Vero TMPRSS2 a través de TCID50 y ensayo de placa. El título es 5 × 105 TCID50/mL en VeroE6 y 1,99 × 108 TCID50/mL en Vero TMPRSS2.

Las partículas de virus informadores (RVP)-GFP utilizadas en el ensayo de neutralización de pseudovirus basado en lentivirus se obtuvieron de Integral Molecular (Tabla 1).

Las células clonales 293T-hsACE2 (Integral Molecular, Cat# C-HA102) utilizadas para el ensayo de neutralización de pseudovirus basado en lentivirus se obtuvieron de Integral Molecular y se cultivaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Se cultivaron células Vero TMPRSS2 (obtenidas de Adrian Creanga, Vaccine Research Center-NIAID) en medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) + suero bovino fetal al 10% (FBS) + gentamicina.

Los experimentos con animales se realizaron de conformidad con todas las normas pertinentes de los Institutos Nacionales de Salud de EE. UU. de acuerdo con los protocolos animales aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) en las instalaciones de investigación. El estudio de NHP se realizó en la Universidad de Louisiana en Lafayette New Iberia Research Center y el estudio de hámster se realizó en Bioqual.

Los macacos Cynomolgus, de 2 a 8 años de edad, se aleatorizaron según el sexo, la edad y el peso. Los grupos estaban compuestos por seis animales, incluidos dos o tres hembras y cuatro o tres machos. Los macacos fueron vacunados en D0 y D21 por vía intramuscular en el músculo deltoides con diferentes formulaciones de vacunas (con adyuvante AS03): monovalente ancestral Spike D614 (5 o 10 µg), monovalente Beta variante Spike (5 o 10 µg) o bivalente D614 + Beta (5 µg + 5 µg) (Fig. 1). Otros dos grupos recibieron la D614 monovalente (5 µg) el D0 y una vacuna heteróloga el D21 compuesta por Beta monovalente (5 µg) o D614 bivalente + Beta (5 µg + 5 µg).

Cinco grupos de seis macacos cynomolgus fueron inmunizados por vía intramuscular con candidatos a la vacuna CoV2 preS dTM-AS03 el día 0 (D0) y el día 21 (D21). Se utilizaron candidatos vacunales monovalentes ancestrales D614 y Beta (B.1.351) a dos dosis de antígeno diferentes: 5 y 10 µg. Se usó el candidato bivalente D614 + Beta a 5 µg + 5 µg.

Se recogieron muestras de sangre antes de la inmunización en D0 y D21, así como en D34, D70, D114, D206 y D365.

Se aleatorizaron hámsteres sirios dorados hembra de 6 a 8 semanas de edad en función del peso. Los candidatos vacunales se administraron el D0 y el D21 por vía intramuscular en el cuádriceps de la pata trasera. Veinticuatro hámsteres por grupo fueron vacunados con D614 monovalente a 1 µg o Beta a 1 µg o con D614 bivalente + Beta a 1 µg + 1 µg. Se recogieron muestras de sangre antes de la inmunización (D0 y D21) y el D35. Veintiocho días después de la segunda dosis, 8 hámsteres por grupo fueron desafiados por vía intranasal con la cepa NY (D614G) a 9,8 × 103 TCID50 (VeroE6) o Beta a 5 × 102 TCID50 (VeroE6) o Alpha a 1,6 × 106 TCID50 , (Vero TMPRSS2) dosis infecciosas previamente determinadas para dar como resultado una pérdida de peso corporal del 10 al 20 % 7 días después del desafío. El peso corporal se controló diariamente hasta el final del estudio, es decir, 4 o 7 días después de la exposición para la mitad del número de animales por grupo por punto de tiempo. Los pulmones se recogieron 4 o 7 días después del desafío para evaluar la carga viral y la patología.

Se obtuvo un panel de suero humano convaleciente (N = 93) de proveedores comerciales (Sanguine Biobank, iSpecimen y PPD). Las muestras de suero se recolectaron dentro de los 3 meses posteriores al diagnóstico PCR positivo de COVID-19 en 2020.

El estándar internacional de la OMS para la inmunoglobulina anti-SARS-CoV-2 (humana) (código NIBSC: 20/136) también se utilizó para permitir la calibración precisa de los ensayos a una unidad arbitraria, reduciendo así la variación entre laboratorios y creando un lenguaje común. para reportar datos.

El ensayo se ha descrito previamente en la ref. 14. Se agregaron las variantes Mu (B.1.621) y Omicron BA.4/5 al panel de pseudovirus (Tabla 1).

Las muestras de suero se diluyeron 1:4 o 1:20 en medios (DMEM sin rojo de fenol FluoroBrite + FBS al 10 % + HEPES 10 mM + PS al 1 % + Glutamax al 1 %) y se inactivaron con calor a 56 °C durante 30 min. Además, se realizó en medios una serie de diluciones dobles de 11 puntos del suero inactivado por calor. Las muestras de suero diluido se mezclaron con la partícula de virus informador (RVP)-GFP (Molecular integral) que se enumeran en la siguiente tabla (Tabla 1) se diluyeron para contener ~300 partículas infecciosas por pocillo y se incubaron durante 1 h a 37 °C. Se inocularon placas de 96 pocillos de células clonales 293T-hsACE2 ~50% confluentes (Integral Molecular, Cat# C-HA102) en un volumen de 75 µL con 50 µL de las mezclas de suero + virus y se incubaron a 37 °C durante 72 h. Al final de la incubación de 72 h, las placas se escanearon en un generador de imágenes de alto contenido y se contaron las células individuales que expresan GFP. El título de anticuerpos neutralizantes se informó como el recíproco de la dilución que redujo el número de placas de virus en la prueba en un 50 %.

El ensayo calificado de pseudovirus D614 ancestral del virus de la estomatitis vesicular (VSV) (Nexelis, Laval, Canadá) se realizó como se describió anteriormente. Brevemente, se produjeron partículas virales pseudotipadas a partir de un esqueleto modificado del virus de la estomatitis vesicular (VSVΔG) que portaba el SARS-CoV-2 Spike (Wuhan) y expresaba el indicador de luciferasa para su detección. Se mezclaron diluciones seriadas dobles de sueros inactivados por calor con 75 000–300 000 unidades de luminiscencia relativa (URL) y se incubaron a 37 °C, CO2 al 5 % durante 60 min. A continuación, la mezcla se transfirió a placas de 96 pocillos previamente sembradas durante la noche con células VeroE6 y se incubó a 37 °C, CO2 al 5 % durante 20 h. Después de la adición del sustrato de luciferasa, se leyó la luminiscencia de las placas en un Spectramax 340PC Versamax). La intensidad de la luminiscencia cuantificada en RLU, es inversamente proporcional a los anticuerpos neutralizantes presentes en el suero. Los títulos de anticuerpos neutralizantes se calcularon como el recíproco de la dilución del suero, lo que resultó en una reducción del 50 % de las RLU medidas en ausencia de suero.

Las IgG específicas de S se analizaron mediante ELISA indirecto. Las placas de micropocillos Nunc se recubrieron con proteína Spike SARS-CoV S-GCN4 (GeneArt, expresada en la línea celular Expi 293) a 0,5 µg/mL en PBS a 4 °C durante la noche. Las placas se lavaron tres veces con PBS-Tween al 0,1 % antes de bloquearlas con BSA al 1 % en PBS-Tween al 0,1 % durante 1 h. Las muestras inactivadas por calor se colocaron en placas a una dilución inicial de 1:450 seguida de diluciones en serie de tres veces y siete puntos en tampón de bloqueo. Las placas se lavaron tres veces después de una incubación de 1 h a temperatura ambiente antes de agregar un anticuerpo secundario. Las placas se incubaron a temperatura ambiente durante 1 h y se lavaron tres veces. Las placas se revelaron con la solución de sustrato Pierce 1-Step Ultra TMB-ELISA durante 6 min y se detuvieron con la solución TMB STOP. Las placas se leyeron a 450 nm en un lector de placas SpectraMax® y los datos se analizaron utilizando el software Softmax® Pro 6.5.1 GxP y el software patentado, Sanofi Universal Exporter 2.1. Los títulos de anticuerpos se informaron como la dilución más alta que es igual al límite de 0,2-OD.

Las células B de memoria se analizaron utilizando el kit ELISpot de células B de un solo color de IgG humana (CTL, CAT# NC1911372). Las PBMC crioconservadas se descongelaron rápidamente en un baño de agua a 37 °C. Se añadió lentamente una mezcla de suero de ternera fetal (FCS)/ADNasa I (200 unidades/ml) a las PBMC, antes de transferirlas a un medio de cultivo celular completo (CM) (RPMI-1640 con FCS al 10 % y cóctel de antibióticos). Después de la centrifugación y resuspensión en 6 ml de CM, las PBMC se transfirieron a placas de seis pocillos y se incubaron a 37 °C con 5 % de CO2 durante 1 hora. Luego, se añadió B-Poly-STM a una dilución 1:1000 para estimulación celular, durante 4 días a 37 °C con 5% de CO2.

Las PBMC preestimuladas se recolectaron y centrifugaron a 433 × g durante 5 min a temperatura ambiente (TA). Después del lavado, las PBMC se contaron utilizando el contador de células Guava® easyCyte y las células se ajustaron a la concentración deseada con CM.

Noventa y seis placas de pocillos con membrana de PVDF se permeabilizaron con 15 μL de etanol al 70 % durante un máximo de 1 min, luego se lavaron tres veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS) estéril 1X antes de recubrirlas con 80 μL de anticuerpo de captura de Ig humana (Ab) diluido a 1:50 o con proteína SARS-CoV2 S-GCN4, cepa Wuhan (GeneArt, expresada en línea celular Expi 293) o cepa BA.5 (Sino Biologicals, expresada en células HEK293) a 4 µg/mL o con PBS. Las placas se incubaron durante la noche a 4 °C y luego se lavaron tres veces con PBS estéril y con CM durante 1 ha TA. Luego se eliminó el CM y se agregaron PBMC a 3 × 105 células/pocillo en la proteína S-GCN4 (cepa Wuhan o BA.5) y pozos recubiertos con PBS, y a 5 × 103 células en los pozos recubiertos con Ab de captura de Ig, menos de 100 μL/pozo. Cada condición se probó por duplicado y las placas se incubaron durante 18 h a 37 °C con 5 % de CO2.

Para revelar las células secretoras de anticuerpos, las placas se lavaron primero dos veces con PBS, luego dos veces con Tween PBS al 0,05 % y luego se añadió solución de detección de IgG antihumana en 80 µl. Después de 2 h de incubación a TA, las placas se lavaron tres veces con Tween PBS al 0,05 % y se añadió una solución terciaria en 80 µL. Las placas se incubaron durante 1 ha TA, luego se lavaron dos veces con Tween PBS al 0,05 % y dos veces con agua destilada. Se añadió una solución de revelador azul por debajo de 80 µl y se incubó a TA durante 15–20 min. La reacción se detuvo lavando la membrana de la placa con agua y decantando tres veces. Las placas se secaron al aire, luego se escanearon y leyeron usando el analizador Cytation 7. El número de puntos con PBS solamente (fondo) se sustrajo del número de puntos de IgG totales o específicos de S. Los resultados se expresan como células B de memoria secretoras de IgG específicas de S/millón de PBMC y como % de células B de memoria secretoras de IgG específicas de S entre todas las células B de memoria secretoras de IgG circulantes.

Las células THP-1 (ATCC) se mantuvieron en RPMI-1640 (Sigma-Aldrich) suplementado con suero fetal bovino (FBS) al 10 %, penicilina/estreptomicina al 5 % (Corning, 50 µg/mL), L-glutamina al 5 % (Corning , 4 mM), tampón HEPES al 5 % (pH 7,2) (Corning, 50 mM) y 2-mercaptoetanol al 0,5 % (Gibco, 275 µM) a 37 °C, CO2 al 5 %. ADCP se realizó como se describió previamente en la ref. 23. Brevemente, se biotinilaron D614 Spike, Beta Spike o Omicron Spike (Sino Biological) y se acoplaron a NeutrAvidin FluoSpheres amarillo-verde (Invitrogen). Los inmunocomplejos se formaron mezclando perlas acopladas a antígeno con suero diluido 1:100 en PBS. Los inmunocomplejos se incubaron durante 2 ha 37 °C y se lavaron en PBS. Las células THP-1 se agregaron a los inmunocomplejos a una concentración de 1,25 × 105 células/mL y se incubaron durante la noche a 37 °C, 5 % de CO2. La capacidad de los anticuerpos para impulsar la captación de perlas por parte de las células THP-1 se evaluó mediante citometría de flujo utilizando un citómetro BD LSR II. PhagoScores se calcularon de la siguiente manera: (% de perlas + células × GeoMean de células)/10000. Las muestras se analizaron por duplicado y los datos representan el promedio de los duplicados.

ADNP se realizó como se describió previamente en la ref. 24. El Instituto Ragon recolectó sangre total periférica de voluntarios sanos. Los voluntarios dieron su consentimiento firmado, tenían más de 18 años y no fueron identificados. El estudio fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional del MGH. Los glóbulos rojos se lisaron mediante lisis con cloruro de amonio y potasio (ACK). Los leucocitos se lavaron con PBS y se mantuvieron en medio RPMI-1640 (Sigma-Aldrich) suplementado con suero fetal bovino (FBS) al 10 % (Sigma-Aldrich), penicilina/estreptomicina al 5 % (Corning, 50 µg/mL), 5 % de l-glutamina (Corning, 4 mM), tampón HEPES al 5% pH 7,2 (Corning, 50 mM) y 37 °C, CO2 al 5% durante la duración del ensayo. Se acoplaron FluoSpheres de NeutrAvidin amarillo-verde al antígeno como se describe para ADCP. Los inmunocomplejos se formaron mezclando suero diluido 1:50 en PBS con perlas acopladas e incubando durante 2 horas a 37 °C. Se lavaron los inmunocomplejos y se agregaron glóbulos blancos a una concentración de 2,5 × 105 células/mL. Las células se incubaron con inmunocomplejos durante 1 hora a 37 °C. Se usó PacBlue anti-CD66b (BioLegend, clon: UCH71) para teñir los neutrófilos. La fagocitosis se midió por citometría de flujo utilizando un iQue (Intellicyt). La fagocitosis por neutrófilos (CD66b+) se calculó como se describe para ADCP. El experimento se realizó con dos donantes y el valor informado es el promedio de los dos donantes.

ADCD se realizó como se describió previamente en la ref. 25. Se acoplaron FluoSpheres Red NeutrAvidin al antígeno como se describe para ADCP. Los inmunocomplejos se formaron mezclando suero diluido 1:10 en PBS con perlas acopladas e incubando durante 2 horas a 37 °C. Los inmunocomplejos se lavaron y se añadió complemento de cobayo liofilizado (Cedarlane) diluido en tampón veronal de gelatina con calcio y magnesio (Sigma-Aldrich) a los inmunocomplejos y se incubó durante 20 min a 37 °C. La deposición de C3 se midió mediante FITC C3 anti-cobaya (MpBio). La fluorescencia se adquirió usando un citómetro BD LSR II. La deposición de C3 se informa como la intensidad de fluorescencia media de FITC. El experimento se realizó por duplicado y el valor informado es el promedio de las dos repeticiones.

ADNKA se realizó como se describió anteriormente en la ref. 26. Las placas ELISA se recubrieron con 2 µg/ml de antígeno y se incubaron durante 2 ha 37 °C. Las placas se lavaron con PBS y se bloquearon durante la noche con albúmina de suero bovino (BSA) al 5 % a 4 °C. Las capas leucocitarias fueron recolectadas por el Hospital General de Massachusetts de donantes sanos que tenían más de 18 años y dieron su consentimiento firmado. Las muestras fueron desidentificadas antes de su uso. Las células NK se aislaron de las capas leucocitarias usando RosetteSep (STEMCELL Technologies) y luego se separaron usando un gradiente de Ficoll. Las células NK se dejaron en reposo durante la noche a 37 °C, 5 % de CO2 en medio R10 (RPMI-1640 (Sigma-Aldrich) suplementado con 10 % de suero fetal bovino (FBS) (Sigma-Aldrich), 5 % de penicilina/estreptomicina (Corning, 50 µg/ml), l-glutamina al 5 % (Corning, 4 mM), tampón HEPES al 5 % (pH 7,2) (Corning, 50 mM)) complementado con 2 ng/ml de IL-15. Al día siguiente, se lavaron las placas y se añadieron a las placas muestras diluidas 1:25 en PBS. Las placas se incubaron durante 2 h a 37 °C, se lavaron y se añadieron células NK a una concentración de 2,5 × 05 células/mL en medio R10 suplementado con anti-CD107a-ficoeritrina (PE)-Cy5 (BD Biosciences, lote n.° 0149826 , dilución 1:1000), brefeldina A (10 µg/ml) (Sigma-Aldrich) y GolgiStop (BD Biosciences). Las placas se incubaron durante 5 ha 37 °C. Después de la incubación, las células se tiñeron para marcadores de superficie con anti-CD3 Pacific Blue (BD Biosciences, clon G10F5), anti-CD16 aloficocianina (APC)-Cy5 (BD Biosciences, clon 3G8) y anti-CD56 PE-Cy7 (BD Biosciences, clon B159) durante 15 min a temperatura ambiente. Las células se fijaron con PermA (Life Technologies) y se permeabilizaron con PermB (Life Technologies) y se tiñeron con anti-MIP-1β PE (BD Biosciences) y anti-IFN gamma FITC durante 15 min a temperatura ambiente. La fluorescencia se analizó mediante citometría de flujo usando un BD LSR II. Las células NK se seleccionaron como CD56 + CD16 + CD3− y la actividad se determinó como el porcentaje de células NK positivas para CD107a, MIP-1b o IFNg. El ensayo se realizó con dos donantes y los datos informados representan el promedio de los dos donantes.

Título de isotipo de anticuerpo específico de antígeno y receptor Fc (FcR): la unión se determinó mediante un ensayo Luminex multiplex, como se describió anteriormente en la ref. 27. Se unieron covalentemente microesferas megaplex carboxiladas (Luminex) a antígenos utilizando enlaces NHS-éster mediante la adición de Sulfo-NHS y EDC (Thermo Fisher). Los inmunocomplejos se formaron agregando un suero diluido a microesferas acopladas a antígeno y las placas se incubaron durante la noche a 4 °C, agitando a 700 rpm. Al día siguiente, las placas se lavaron con BSA al 0,1 % y Tween-20 al 0,02 %. Para la detección del título de isotipo de anticuerpo, se añadieron a las placas anticuerpos de detección antihumanos de ratón acoplados a PE (Southern Biotech). Para la detección de la unión a FcR, se biotinilaron FcR humanos marcados con Avi (Duke Human Vaccine Institute) usando un kit BirA500 (Avidity) según las instrucciones del fabricante y marcados con estreptavidina-PE. El FcR marcado con PE se añadió al inmunocomplejo. La fluorescencia se adquirió utilizando un iQue (Intellicyt) y los datos representan la intensidad de fluorescencia media (MFI). El ensayo Luminex se realizó por duplicado y los datos informados representan el promedio de los duplicados. Cada ensayo Luminex se realizó con diluciones múltiples para el mismo antígeno. Se mostraron datos representativos.

El ensayo TCID50 se realizó mediante la adición de diluciones graduadas diez veces de muestras a monocapas de TMPRSS2. Específicamente, las células Vero TMPRSS2 (obtenidas de Adrian Creanga, Vaccine Research Center-NIAID) se sembraron en placa a 25 000 células/pocillo en DMEM + 10 % FBS + Gentamicina y los cultivos se incubaron a 37 °C, 5 % CO2. El medio se aspiró y se reemplazó con 180 μL de DMEM + 2% FBS + gentamicina. Se agregaron veinte (20) μL de la muestra a la fila superior por cuadruplicado y se mezcló con una pipeta P200 cinco veces. Usando la pipeta, se transfirieron 20 μL a la siguiente fila y se repitieron en la placa (columnas A–H), lo que representa diluciones de diez veces. Las puntas se dispusieron para cada fila y se repitieron hasta la última fila. Se incluyeron pocillos de control positivos (reserva de virus de título infeccioso conocido en el ensayo) y negativos (solo medio) en cada configuración de ensayo. Las placas se incubaron a 37 °C, 5 % de CO2 durante 4 días. Las monocapas de células se inspeccionaron visualmente para determinar el efecto citopático (CPE). El valor TCID50 se calculó utilizando la fórmula de Read-Muench. Para las muestras que tenían menos de 3 pocillos positivos para CPE, la TCID50 no se pudo calcular utilizando la fórmula de Reed-Muench, y a estas muestras se les asignó un título por debajo del límite de detección (es decir, desafío prototipo D614G 1,569 TCID50/gramo, desafío Alpha 1,652 TCID50/gramo y desafío Beta 1.550 TCID50/gramo). Para un rendimiento óptimo del ensayo, el valor de TCID50 del control positivo debe ser el doble del valor esperado.

Se recogieron muestras de pulmón de hámster izquierdo completo en formalina tamponada neutra (NBF) al 10 %, se procesaron de forma rutinaria y se incluyeron en parafina. Los bloques de parafina se seccionaron a aproximadamente 5 micras y se tiñeron con hematoxilina y eosina (H&E). Un patólogo veterinario certificado por la junta evaluó a ciegas los portaobjetos de H&E tanto cualitativa como semicuantitativamente para la patología pulmonar. Se realizaron puntuaciones semicuantitativas basadas en el porcentaje de pulmones afectados. Los pulmones que coincidían con tejido normal recibieron una puntuación de 0. Si menos del 25 % de la sección reveló histopatología, se asignó una puntuación de 1. Se atribuyó una puntuación de 2 a las secciones de pulmón en las que la histopatología estaba presente en más del 25 % pero menos del 50 % del pulmón. Si se afectaba más del 50% del parénquima pulmonar, se asignaba una puntuación de 3. La expresión de la proteína de la nucleocápside se evaluó mediante inmunohistoquímica basada en cromógeno DAB con un anticuerpo de nucleocápside policlonal anti-SARS-CoV-2 de conejo (GTX135357, GeneTex, Inc, EE. UU.) en la plataforma de inmunotinción automatizada Leica BondRX (Leica, EE. UU.) como se describió anteriormente28. El área inmunopositiva de nucleocápside se midió en secciones de pulmón utilizando un algoritmo de porcentaje de área del software de análisis de imágenes HALO (Indica Labs, EE. UU.).

La potencia del estudio se estimó con base en el título neutralizante de pseudovirus, considerando que la diferencia mínima pertinente correspondía al triple (0,5 log), con una desviación estándar de 0,3 log (es decir, observada en estudios previos). En tal contexto, se consideró aceptable un tamaño de muestra de 6 NHP por grupo para mostrar una diferencia entre los 11 grupos con un poder superior al 75%.

En el momento de la asignación, las características iniciales (sexo, edad y peso) se equilibraron para tener grupos comparables. Los títulos de ELISA y los títulos de neutralización se transformaron en log10 antes del análisis estadístico.

Todas las pruebas estadísticas fueron bilaterales, el nivel nominal de significación estadística se fijó en α = 0,05 para las estimaciones del tamaño del efecto, α = 0,01 para las pruebas de normalidad y α = 0,10 para los términos de interacción. Los análisis se realizaron en SEG SAS v9.4®.

Para todas las lecturas de los estudios de NHP y los títulos de ELISA del estudio del hámster, se realizaron análisis utilizando modelos mixtos con el producto, el tiempo y su interacción como factores fijos, un tiempo considerado como repetido y las cohortes añadidas como un efecto aleatorio para el hámster. estudiar. Para neutralizar los títulos del estudio de hámster, así como las respuestas de células B de memoria secretoras de IgG específicas de Spike de Omicron BA.5 del estudio NHP, ya que solo había datos de un punto de tiempo disponibles, se realizó un ANOVA unidireccional usando un modelo mixto con un producto como Se realizó un factor fijo y cohortes como efecto aleatorio. Se verificó la normalidad de los residuales del modelo mediante un Gráfico de Probabilidad Normal, y los resultados se consideraron aceptables.

Se realizó la correlación de Spearman entre los títulos de PsV y la pérdida de peso.

Para el análisis univariado de serología del sistema, las estadísticas se calcularon utilizando GraphPad Prism versión 8.0. La significación se determinó mediante una prueba de Kruskal-Wallis. Los mapas de calor y los diagramas polares se crearon en Python (versión 3.9.1). Los diagramas polares muestran el rango de percentil mediano para cada característica. Los mapas de calor muestran los datos con puntuación z.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de investigación de Nature vinculado a este artículo.

Primero verificamos la posible interferencia inmunológica entre las dos valencias en la formulación bivalente en comparación con las formulaciones monovalentes D614 o Beta. Los macacos cynomolgus ingenuos se inmunizaron el D0 y el D21 con la formulación de vacuna bivalente CoV2 preS dTM-AS03 (D614 + Beta) a una dosis de 5 µg + 5 µg, o vacunas monovalentes CoV2 preS dTM-AS03 (D614 o Beta) a 5 µg y 10 dosis de µg (fig. 1).

Las respuestas de anticuerpos neutralizantes contra la cepa D614 ancestral de Wuhan y el Beta VOC se analizaron dos semanas después de la dosis 2 utilizando ensayos de pseudovirus basados ​​en lentivirus (lentivirus-PsV). El candidato a vacuna bivalente provocó títulos de nAb altos y constantes contra el SARS-CoV-2 D614 ancestral, con títulos medios de 3,0 log10 ± 0,4 log10 desviación estándar (DE) (Fig. 1a complementaria), no significativamente diferentes de los inducidos por el D614 monovalente a 5 µg (títulos medios de 3,1 log10) y 10 µg (títulos medios de 3,4 log10), pero significativamente más altos que los provocados por la vacuna Beta monovalente a 10 µg (títulos medios de 2,3 log10, P = 0,0017, aumento medio de veces 4,9 ). La ausencia de interferencias inmunitarias negativas en la formulación bivalente se confirmó mediante un ensayo calificado de pseudovirus del virus de la estomatitis vesicular (VSV) D614 (Fig. 1b complementaria).

Como era de esperar, la vacuna bivalente también provocó títulos de nAb altos y constantes contra el pseudovirus Beta en todos los macacos, con una media de 3,0 log10 ± 0,3 log10 SD, equivalentes a los inducidos por la vacuna Beta monovalente a 5 µg y 10 µg (Fig. 1c) y significativamente más altas que las inducidas por el D614 monovalente a 10 µg (aumento medio de siete veces, P < 0,001).

En general, el CoV2 preS dTM-AS03 bivalente indujo títulos de nAb robustos y equilibrados contra la cepa ancestral D614 y la variante Beta, sin interferencias inmunitarias detectables.

A continuación, evaluamos la amplitud de la neutralización conferida por la vacuna bivalente frente a otros VOC, D614G, Alpha y Delta (todos con la posición original E484), Gamma y Mu (que contienen la mutación E484K presente en Beta) y el Omicron BA más distante. 1 (que contiene la mutación E484A entre 15 mutaciones en el RBD) y SARS-CoV-1. La vacuna bivalente se comparó con las formulaciones de vacunas monovalentes en el mismo momento (es decir, 2 semanas después de la segunda dosis) (Fig. 2a).

Se inmunizaron grupos de seis macacos vírgenes dos veces con un intervalo de 3 semanas con la vacuna bivalente (5 µg + 5 µg), D614 monovalente o Beta monovalente (10 µg). Los títulos de anticuerpos neutralizantes se midieron 2 semanas después de la segunda dosis. a Títulos de anticuerpos neutralizantes de pseudovirus basados ​​en Lentivirus contra el D614 ancestral y el prototipo D614G, variantes de interés (Alpha, Beta, Gamma, Delta, Mu y Omicron BA.1) y SARS-CoV-1 a las 2 semanas después de la dosis 2 Se mostraron datos de macacos individuales. b Se analizó un panel de sueros humanos convalecientes (N = 93) contra el pseudovirus ancestral D614 y se representa como un comparador. La línea discontinua representa el estándar internacional de la Organización Mundial de la Salud (OMS) para el código NIBSC de inmunoglobulina (humana) anti-SARS-CoV2: 20/136. Las líneas de puntos horizontales indican los límites de cuantificación del ensayo. Las barras representan medias e intervalos de confianza del 95%.

La vacuna bivalente provocó títulos de nAb altos y homogéneos contra todos los VOC, excepto Omicron BA.1, con títulos medios que oscilaron entre 2,8 log10 contra Delta y 3,5 log10 contra Gamma. Cuando se comparó con la vacuna monovalente D614 (10 µg), la vacuna bivalente provocó títulos de nAb equivalentes contra D614, D614G, Alpha y Delta (títulos medios de 3 a 3,5 log10), pero títulos de nAb más altos contra Beta, Gamma y Mu ( títulos medios de 2,2 a 2,4 log10, P < 0,001, aumento medio de 6,1 a 12,2). Por el contrario, en comparación con la beta monovalente, la vacuna bivalente indujo títulos de nAb más altos contra D614, D614G, Alpha y Delta (títulos medios de 2,1 a 2,5 log10, aumento medio de veces de 3,3 a 5,8, P < 0,05) pero títulos de nAb equivalentes contra Beta, Gamma y Mu (títulos medios de 2,9 a 3,3 log10).

Para Omicron BA.1 y SARS-CoV-1, la vacuna bivalente indujo títulos detectables en todos los animales, con títulos medios de alrededor de 2,0 log10, mientras que las respuestas de nAb fueron más variables en los grupos de vacunas monovalentes.

Los resultados indican que la vacuna candidata bivalente ancestral/Beta provoca respuestas nAb sólidas y equilibradas contra los virus que contienen E484 originales (D614, D614G, Alpha y Delta), los virus que contienen E484K (Beta, Gamma y Mu) y los virus inferiores. pero respuestas consistentes de nAb contra el distante Omicron BA.1 (E484A) y SARS-CoV-1.

A modo de comparación, la vacuna bivalente provocó títulos medios de nAb D614 más altos que los medidos en el Estándar internacional de la Organización Mundial de la Salud (OMS) para inmunoglobulina anti-SARS-CoV-2 (código NIBSC: 20/136; 2,8 log10 en nuestro ensayo de lentivirus-pseudovirus ) y superiores a los medidos en un panel de 93 sueros humanos convalecientes (recolectados dentro de los 3 meses posteriores a la prueba de PCR positiva; 2,0 log10; Fig. 2b). El Estándar Internacional para inmunoglobulinas anti-SARS-CoV-2, adoptado por el Comité de Expertos en Estandarización Biológica de la OMS el 10 de diciembre de 2020, permite comparar los títulos contra D614 generados en diferentes ensayos de neutralización, se le ha asignado una potencia de 1000 UI/ ml29.

Para evaluar el beneficio de la inmunización heteróloga de sensibilización/refuerzo en la neutralización cruzada, se probaron dos regímenes de inmunización alternativos, donde una primera dosis con el monovalente D614 (5 µg) (D0) fue seguida por una segunda dosis (D21) con el monovalente Vacunas beta (5 µg) o bivalentes (5 µg + 5 µg) (Fig. 2a complementaria).

En comparación con el régimen de 2 dosis de la vacuna monovalente D614, la segunda inyección con Beta monovalente pudo extender la amplitud de la respuesta neutralizante a Beta y otros COV, mientras que la segunda inyección con la bivalente no mejoró la amplitud. Sin embargo, la preparación/refuerzo heterólogo con Beta monovalente para la segunda inyección indujo una mayor variabilidad y títulos ligeramente más bajos que el régimen de dos dosis de la vacuna bivalente (no significativo para los títulos medios de nAb D614, D614G, Alpha y Delta, 3- y 4.1- veces más bajo para Beta, P = 0.0165 y Gamma, P = 0.0052 títulos medios de nAb, respectivamente) (Fig. 2b complementaria).

Para abordar la potencial disminución de Ab neutralizantes, medimos los títulos de nAb contra el prototipo D614G, Beta y Omicron BA.1 en la sangre de animales vacunados hasta 1 año después de la inmunización (D365) con las formulaciones de vacuna bivalente y monovalente a 10 µg de dosis total de antígeno (Fig. 3).

Los títulos de anticuerpos neutralizantes de pseudovirus contra a el prototipo D614G SARS-CoV-2, b la variante Beta yc la variante Omicron (BA.1) se evaluaron en diferentes puntos de tiempo después de la inmunización en macacos cynomolgus con monovalente D614 (10 µg), monovalente Beta (10 µg) o bivalente D614 + Beta (5 µg + 5 µg). Se muestran datos de macacos individuales (N = 6/grupo). Las líneas de conexión indican las respuestas medias y la línea punteada horizontal es el límite de cuantificación del ensayo.

Para cada formulación de vacuna, los títulos de nAb contra el prototipo D614G y la variante Beta alcanzaron su punto máximo en D34, disminuyeron hasta D70 o D114 y luego permanecieron estables hasta por 1 año (D365). Al año, los títulos medios de nAb frente al prototipo D614G y la variante Beta fueron, respectivamente, 2,7 y 2,5 log10 para la vacuna bivalente, 2,8 y 1,8 log10 para la monovalente D614 y 2,4 y 2,6 log10 para la beta monovalente (fig. 3a, b).

Los títulos neutralizantes frente a Omicron BA.1 se evaluaron en D0, D34, D206 y D365 y frente a BA.4/5 al cabo de 1 año. Todos los animales tenían títulos detectables de nAb BA.1 PsV hasta un año, excepto en el grupo de vacuna monovalente D614 (Fig. 3c). Los títulos medios de nAb contra Omicron BA.1 (Fig. 3c) y BA.4/5 (Fig. 4) al año fueron, respectivamente, 2,2 y 2,0 log10 para el bivalente, 1,7 y 1,7 log10 para el monovalente D614 y 2,1 y 1,7 log10 para la Beta monovalente.

Se muestran los títulos de anticuerpos neutralizantes de pseudovirus contra Omicron BA.4/5 en sueros de macacos individuales (N = 6/grupo; faltaba una muestra en el grupo de vacuna monovalente Beta). Diamantes azules: formulación bivalente D614 + Beta; cuadrados negros: formulación D614; puntos morados: Formulación Beta. Las barras indican las respuestas medias y las líneas de puntos horizontales corresponden a la inversa de la dilución más baja del ensayo.

Los títulos medios de nAb alfa y gamma a los 3 meses (D114) fueron, respectivamente, 2,6 y 2,6 log10 para los grupos de vacunas bivalentes, 2,7 y 2,1 log10 para la vacuna monovalente D614, 2,3 y 2,8 log10 para la beta monovalente (Fig. 3a complementaria, b). Los títulos medios de nAb de la variante Delta a los 7 meses (D206) fueron 2,1 log10 (bivalente), 2,2 log10 (monovalente D614) y 1,8 log10 (beta monovalente) (Fig. 3c complementaria).

Curiosamente, la disminución parecía menos pronunciada para las respuestas de neutralización cruzada que para las respuestas de neutralización homólogas a la vacuna. Es de destacar que las respuestas de neutralización cruzada tendieron a alcanzar su punto máximo en títulos más bajos que las respuestas de neutralización homólogas a la vacuna (Fig. 3 y Fig. 3 complementaria). Por lo tanto, la diferencia entre los títulos neutralizantes homólogos y heterólogos fue menor 1 año después de la inmunización que 2 semanas después de la segunda dosis. Esto es válido especialmente para Omicron BA.1, para el que no se observó una disminución significativa de los títulos de nAb con las tres formulaciones de vacunas entre D34 y 1 año.

El modelado del decaimiento de Ab basado en los datos experimentales indicó que, después del decaimiento inicial, los títulos de nAb del prototipo D614G alcanzaron una meseta en el grupo bivalente en D98 a 2,6 log10 y permanecieron estables hasta 1 año (D365). Para el grupo de 10 µg de D614 monovalente, se alcanzó una meseta en D89, con un título medio estimado en 2,8 log10. En el grupo de Beta monovalente de 10 µg, la meseta se alcanzó en D34 a 2,3 log10, lo que indica que no hubo deterioro del nAb D614G durante un año en este grupo.

Los títulos de Beta nAb alcanzaron una meseta para todos los grupos, estimados en 2,4 log10 en D111, 1,8 log10 en D113, 2,5 log10 en D114 para bivalente, monovalente D614 y monovalente Beta, respectivamente.

Con respecto a los títulos de nAb de Omicron BA.1, no se realizó ningún modelo matemático debido a los pocos puntos de tiempo (D34, 206 y 365) evaluados después de la inmunización; sin embargo, no se observó un efecto de tiempo estadísticamente significativo desde D34 hasta 1 año (D365), lo que significa los títulos neutralizantes fueron estables durante 1 año.

Al cabo de 1 año, se detectaron respuestas de células B de memoria secretoras de IgG específicas de Spike D614 ancestrales y Omicron BA.5 para todos los animales a niveles similares en los tres grupos de vacunas, es decir, bivalente, monovalente D614 y monovalente Beta (Fig. 5). Cuando se ajustó al total de células B de memoria IgG, las respuestas fueron muy homogéneas dentro de los grupos. Las medianas de las células B de memoria secretoras de IgG totales/específicas de S D614 ancestrales fueron 0,46, 0,19 y 0,39 % para los grupos de vacunas beta bivalente, monovalente D614 y monovalente, respectivamente. Se detectaron significativamente más células B ancestrales D614 Spike-memory en los grupos beta bivalentes y monovalentes en comparación con la formulación monovalente D614. Las medianas de las células B de memoria secretoras de IgG específicas/totales de Omicron BA.5 S fueron 0,21, 0,19 y 0,29 % para los grupos de vacuna bivalente, monovalente D614 y beta monovalente, respectivamente, sin diferencias significativas entre los grupos.

Respuestas de células B de memoria secretoras de IgG específicas de pico a 1 año inducidas por las vacunas CoV2 preS dTM-AS03 bivalentes y monovalentes contra un pico D614 ancestral y un pico b Omicron BA.5. Los símbolos representan la frecuencia individual de células B de memoria secretoras de IgG específicas/S totales (%) en macacos inmunizados con la vacuna bivalente (5 µg + 5 µg) (diamantes azules), monovalente D614 (10 µg) (cuadrados negros) o Beta monovalente (10 µg) (puntos morados) y barras en la mediana de cada grupo.

Además de neutralizar los anticuerpos, se evaluaron las funciones efectoras de anticuerpos y de unión al receptor Fc, ya que se ha demostrado previamente que contribuyen a la eliminación de la infección por SARS-CoV-230. La formulación bivalente provocó títulos similares de IgG1 y anticuerpos de unión a FcR2a contra D614 y Beta Spikes en comparación con las formulaciones de vacunas monovalentes a 5 y 10 µg (Fig. 6a, b).

a Los diagramas de puntos muestran el título de IgG1 contra D614 (izquierda) o Beta (derecha) Spike. b Los diagramas de puntos muestran el título de unión a FcR2a contra D614 ancestral (paneles de la izquierda) o Beta (paneles de la derecha) Spike. c Los diagramas de puntos muestran la fagocitosis celular dependiente de anticuerpos (ADCP) contra D614 ancestral (izquierda) o Beta (derecha) Spike. d Los diagramas de puntos muestran el depósito de complemento dependiente de anticuerpos (ADCD) contra D614 ancestral (izquierda) o Beta (derecha) Spike. e Los mapas de calor muestran la mediana de la puntuación z para todas las características de anticuerpos medidas contra el ancestral D614 Spike (izquierda) o Beta Spike (derecha). La significación se determinó mediante una prueba de Kruskal-Wallis seguida de una corrección del valor p post hoc de Benjamini-Hochberg para comparaciones múltiples. MFI intensidad de fluorescencia media. a–d Los símbolos representan valores individuales en macacos inmunizados con la vacuna bivalente (5 µg + 5 µg) (puntos negros), vacunas monovalentes a 5 µg (puntos rojos) o vacunas monovalentes a 10 µg (puntos verdes) y barras en la mediana de cada grupo.

Luego medimos la capacidad de los anticuerpos de estas diferentes formulaciones de vacunas para inducir funciones efectoras celulares. Encontramos que la formulación bivalente indujo significativamente menos fagocitosis celular dependiente de anticuerpos (ADCP) contra D614 Spike en comparación con la formulación monovalente a 10 µg (Fig. 6c). No se observaron diferencias significativas en la capacidad de los anticuerpos para provocar el depósito de complemento dependiente de anticuerpos (ADCD) (Fig. 6d).

Para comprender la diferencia entre las formulaciones bivalentes y monovalentes en un nivel amplio, trazamos un mapa de calor de la puntuación z de todos los títulos de anticuerpos medidos, la unión a FcR y las funciones efectoras de anticuerpos contra D614 (Fig. 6e, paneles de la izquierda) o Beta (Fig. 6e, paneles derechos). Este análisis no reveló ningún patrón específico que discrimine las formulaciones bivalentes de las monovalentes. Estos datos destacan que la formulación bivalente induce un título de anticuerpos de subclase IgG robusto y una función de unión a FcR, comparable a las formulaciones monovalentes.

Se realizaron análisis adicionales de las funciones efectoras inducidas por las diferentes formulaciones frente a la variante de Omicron (BA.1) Spike. El título de unión de IgG1 a Omicron Spike estuvo altamente correlacionado con la unión de IgG1 D614G (Fig. 4a complementaria), pero mostró una unión disminuida como se muestra en estudios previos31. La formulación bivalente indujo anticuerpos específicos de Spike contra Omicron con títulos similares (suplementario. Fig. 4b) y unión similar a FcR2a y FcR3a (suplementario Fig. 4c) en comparación con las formulaciones monovalentes D614 y Beta a 5 y 10 µg. Mientras que todas las formulaciones indujeron una fagocitosis celular y de neutrófilos dependiente de anticuerpos similar (ADCP y ADNP, respectivamente), la formulación monovalente Beta de 10 µg indujo una ADCD más alta que la formulación monovalente Beta de 5 µg, y tuvo una tendencia más alta que todas las demás formulaciones (Fig. 4d complementaria) . No está claro si el aumento en la actividad de ADCD se debe simplemente a una mayor dosis de vacuna oa la inducción de IgM contra Omicron.

Finalmente, para comprender si la formulación de la vacuna bivalente induce una respuesta de anticuerpos más amplia, trazamos el rango percentil medio de los títulos de IgG1 para la formulación bivalente y las cuatro formulaciones monovalentes contra D614G, Omicron, Alpha, Beta y Delta Spike (Suplementario Figura 4e). Este análisis sugiere que la formulación bivalente y las dos formulaciones monovalentes D614 y Beta a 10 µg pueden ofrecer una respuesta de IgG más amplia que las formulaciones monovalentes a 5 µg.

A continuación, investigamos la protección conferida por la vacuna bivalente en hámsters sirios dorados contra la replicación viral y la patología pulmonar inducida por el desafío viral con el prototipo D614G, variantes Alfa y Beta. Se inmunizaron tres cohortes de 32 hámsters (cada uno dividido en cuatro grupos de ocho animales) con tampón (grupo de control), monovalente D614, monovalente Beta o bivalente (D614 + Beta) CoV2 preS dTM-AS03, usando la dosis de dos Régimen D0/D21, por vía intramuscular a 1 µg de cada antígeno (Fig. 7a). Cuatro semanas después de la segunda dosis, cada cohorte fue desafiada con el prototipo de virus D614G, Alfa o Beta, utilizando dosis infecciosas previamente caracterizadas para inducir entre un 10 y un 20 % de pérdida de peso corporal.

un esquema de estudio. Los hámsteres fueron vacunados con la bivalente D614 + Beta (1 µg + 1 µg) y la monovalente D614 o Beta (1 µg), en D0 y D21. b Los títulos de IgG específica para S se analizaron en hámsters individuales inmunizados con la vacuna bivalente (diamantes azules), la vacuna monovalente D614 (cuadrados negros) o la vacuna beta monovalente (puntos morados) en D0, D21 (después de la primera dosis), y D35 (después de la segunda dosis). c Los títulos de nAb de PsV contra el prototipo D614G, las variantes alfa, delta y beta se analizaron en D35 en hámsteres vacunados y no vacunados. Los símbolos representan datos individuales y las barras la media del grupo. Las líneas de puntos horizontales corresponden al inverso de la dilución más baja de los ensayos.

Antes del desafío, se evaluaron los títulos de IgG (ELISA) y nAb específicos de S contra el prototipo D614G, Alpha, Beta y Delta VOC en sueros de hámsters vacunados y no vacunados, utilizando ensayos de lentivirus-pseudovirus. Las diferentes formulaciones de vacunas indujeron IgG específicas de S en todos los hámsters 21 días después de la primera inyección excepto en 1 y 2 hámsteres en los grupos de vacuna monovalente D614 y Beta, respectivamente. Los títulos medios de IgG variaron de 3,2 a 3,5 log10 Unidades ELISA (EU), como se muestra en la Fig. 7b, y fueron comparables en todos los grupos de vacunas. Los títulos medios de IgG específica para S aumentaron a ~5,0 log10 EU, 2 semanas después de la segunda dosis, sin diferencias estadísticamente significativas entre las diferentes formulaciones de vacunas. De acuerdo con las observaciones anteriores en macacos, la formulación de vacuna bivalente provocó títulos de nAb altos y equilibrados en D35 frente al prototipo D614G, Alpha, Delta y Beta con títulos medios entre 2,7 y 3,2 log10 (Fig. 7c). La formulación monovalente D614 indujo títulos de nAb altos y equilibrados frente al prototipo D614G, Alpha y Delta (títulos medios entre 2,9 y 3,1 log10), mientras que los nAbs fueron más bajos frente a Beta (títulos medios de 1,5 log10). Cabe señalar que dos hámsteres vacunados con la vacuna monovalente D614 tenían títulos bajos de IgG específica de S (3,0 y 4,2 log10 EU) y títulos de nAb no detectables, 2 semanas después de la segunda dosis. Por el contrario, la formulación Beta monovalente indujo solo títulos altos de nAb contra el pseudovirus Beta homólogo (títulos medios de 3,1 log10) y títulos más bajos de nAb contra el prototipo D614G, Alpha y Delta (títulos medios entre 1,9 y 2,5 log10; Fig. 7c). Esos datos están en línea con nuestras observaciones en macacos que no muestran interferencias inmunes entre los dos antígenos.

Se observaron títulos de nAb más altos estadísticamente significativos contra Beta con la formulación bivalente en comparación con la formulación monovalente D614 (38 veces, P < 0,001), y para el prototipo D614G (6,5 veces, P < 0,001), Alfa (3,7 veces, P < 0,001). P = 0,0144) y Delta (7,3 veces, P < 0,001) títulos de nAb en comparación con la vacuna Beta monovalente.

Para evaluar la protección contra el prototipo (D614G) y las variantes (Alfa y Beta), se controló el cambio de peso corporal hasta 7 días después del desafío como marcador de progresión de la enfermedad, y se evaluaron las cargas virales y la patología pulmonar después de la necropsia en D4 o D7 en la mitad de los animales. Los hámsteres no vacunados (tampón) perdieron hasta el 18 % del peso corporal 7 días después del desafío con Beta y Alpha y hasta el 10 % después del desafío del prototipo D614G (Fig. 8a), mientras que los pesos de los hámsteres no vacunados se mantuvieron estables o aumentaron ligeramente durante el Mismo periodo. A excepción de los dos hámsteres con baja respuesta (sin títulos de nAb) vacunados con la vacuna monovalente D614, todos los hámsteres vacunados, independientemente de las formulaciones de la vacuna, tenían un peso corporal estable o ligeramente aumentado después de la exposición, siguiendo el mismo perfil que el grupo no expuesto.

Los hámsteres vacunados con el bivalente D614 + Beta (1 µg + 1 µg) y el monovalente D614 o Beta a (1 µg), fueron desafiados (N = 8/grupo) con virus prototipo D614G, Alfa o Beta, 28 días después de la segunda dosis a El cambio de peso corporal individual se evaluó diariamente, durante los 7 días posteriores al desafío. Los símbolos representan datos individuales y las líneas la media del grupo. b Carga viral por titulación infecciosa, c puntuación de patología (basada en el % de tejido afectado: 0 = 0 %; 1 < 25 %; 2 = 25–50 %; 3 > 50 %) y d el porcentaje de área de proteína de la nucleocápside se evaluó en los pulmones de hámster individual, 4 o 7 días después del desafío. Las barras representan la mediana del grupo para la puntuación de patología y el porcentaje de área de proteína de la nucleocápside, la línea discontinua representa el límite de detección.

Las cargas virales se midieron en los pulmones 4 y 7 días después del desafío (la mitad de los animales por grupo y por punto de tiempo) usando una titulación de dosis infecciosa de cultivo de tejido al 50 % (TCID50). En cada cohorte, el grupo no vacunado (tampón) mostró cargas virales altas 4 días después del desafío con cargas virales medias de 8,8 log10, 8,6 log10 y 8,3 log10 TCID50 en las cohortes D614G, Alfa y Beta, respectivamente (Fig. 8b) . En el D4 posterior al desafío, los hámsteres vacunados con las vacunas Beta bivalente o monovalente mostraron cargas virales bajas o indetectables, independientemente del virus utilizado para el desafío (D614G, Alfa o Beta). Los hámsteres vacunados con la vacuna monovalente D614 también mostraron cargas virales bajas a indetectables en D4, excepto los dos hámsteres en la cohorte de desafío Alfa que mostraron cargas virales altas consistentes con la pérdida de peso corporal y títulos de nAb no detectables. Un hámster vacunado con la vacuna monovalente D614 también mostró una carga viral alta en la cohorte desafiada con la variante Beta.

En las tres cohortes, los títulos infecciosos fueron de bajos a indetectables 7 días después del desafío.

A continuación, evaluamos la patología pulmonar 4 y 7 días después del desafío mediante la evaluación microscópica de secciones de pulmón teñidas con hematoxilina y eosina (H&E) o sometidas a inmunohistoquímica (IHC) de proteína de nucleocápside anti-SARS-CoV-2. Para las tres cepas virales, la patología en los hámsteres no vacunados (tampón) consistió en regiones multifocales a coalescentes de infiltrado inflamatorio compuesto por macrófagos, linfocitos, heterófilos y células sincitiales mezclados con hemorragia y restos celulares que a menudo obliteran la arquitectura normal (Fig. 9a y Fig. Suplementaria). 5). Había marcada hiperplasia de neumocitos tipo II y el epitelio bronquiolar era multifocalmente hiperplásico caracterizado por muchas células epiteliales amontonadas e intercaladas con raras células necróticas. La luz de algunos bronquiolos contenía restos celulares necróticos. Los vasos sanguíneos revelan una infiltración mural o perivascular por infiltrados inflamatorios mixtos. La patología pulmonar se atenuó notablemente en los hámsteres que recibieron la vacunación. Se realizaron puntuaciones semicuantitativas basadas en el porcentaje de pulmón afectado.

Microfotografías representativas de bajo aumento (8x) (H&E). Los pulmones de los hámsteres que recibieron solo tampón, las vacunas monovalente D614 o Beta (1 µg) y la vacuna bivalente D614 + Beta (1 µg + 1 µg) se evaluaron después de la tinción con H&E, 7 días después de la exposición con el prototipo D614G, Alpha y Beta virus Flechas = infiltrado inflamatorio, hiperplasia de neumocitos tipo II, restos celulares representados por regiones de color púrpura oscuro. b La expresión de la proteína de la nucleocápside se analizó mediante inmunohistoquímica en los pulmones de hámsters 4 días después de la exposición a los virus prototipo D614G, Alfa y Beta.

Todos los hámsteres no vacunados tenían puntuaciones medianas de patología pulmonar de 2 (en una escala de 0 a 3), 4 días después del desafío con el prototipo D614G y Alpha, y una puntuación de 1 o 2 en el grupo desafiado con Beta (Fig. 8c). Siete días después de la exposición, la patología progresó en todos los animales no vacunados hasta la puntuación máxima de 3, independientemente de la cepa utilizada para la exposición. Por el contrario, los hámsteres vacunados con las vacunas monovalente o bivalente no mostraron patología o la presentaron mínimamente (puntuaciones de 0 o 1), en el día 4 o 7 después del desafío, a excepción de los dos hámsteres de baja respuesta vacunados con D614 y desafiados con la variante Alfa. que mostró puntajes de 2 y 3, consistentes con las altas cargas virales. En la misma cohorte (desafío Alfa), un hámster vacunado con Beta monovalente mostró una puntuación de 2, 4 días después del desafío; sin embargo, el análisis post hoc indicó que la patología estaba menos desarrollada que en los controles inmunizados con tampón con puntuaciones similares. Además, mientras que la inmunohistoquímica mostró la expresión de la proteína de la nucleocápside en regiones multifocales a coalescentes de los pulmones en hámsteres no vacunados 4 días después del desafío, la proteína de la nucleocápside no se detectó en ningún hámster vacunado en el mismo punto de tiempo, excepto en los dos animales de baja respuesta inmunizados con la vacuna monovalente. Vacuna D614 (Figs. 8d, 9b).

En general, la vacuna bivalente D614/Beta, así como las dos vacunas monovalentes CoV2 preS dTM-AS03 (D614 y Beta), confirieron protección en hámsteres contra la pérdida de peso corporal, la replicación viral en los pulmones y la patología pulmonar inducida por el prototipo D614G, Alpha o Variantes beta.

La transmisión del SARS-CoV-2 aún no está controlada en muchas partes del mundo, y la aparición de variantes resistentes a la vacuna como Omicron y sus subvariantes ha puesto de relieve las limitaciones de las estrategias de refuerzo de vacunas basadas en la cepa ancestral D614 Wuhan y ha estimulado el desarrollo de nuevas formulaciones de refuerzo de vacunas basadas en picos variantes32,33,34,35,36.

Aquí, evaluamos la inmunogenicidad y la eficacia conferidas por una formulación de vacuna bivalente recombinante CoV2 preS dTM con adyuvante AS03 que contiene los trímeros Spike estabilizados por prefusión de las cepas variantes ancestrales D614 y Beta (B.1.351) en NHP y hámsters ingenuos después de un serie de vacunación primaria. El modelo NHP tiene una alta predictibilidad para la inmunogenicidad de la vacuna COVID-19 y el hámster dorado sirio ha demostrado ser un modelo de elección para evaluar la eficacia de la vacuna contra la patología causada por las variantes del SARS-CoV-237,38.

Los hallazgos de nuestro estudio demuestran la inmunogenicidad amplia y duradera conferida por la vacuna CoV2 preS dTM-AS03 basada en proteína bivalente D614/Beta en NHP hasta 1 año. En concreto, la vacuna bivalente induce altas respuestas de anticuerpos neutralizantes frente a los virus homólogos a la vacuna (D614, D614G y Beta) y VOC Alfa, Gamma, Delta y Mu, alcanzando niveles estables entre 3 y 12 meses. Es importante destacar que la vacuna bivalente también provoca anticuerpos de neutralización cruzada contra el SARS-CoV-1 del brote de 2003, así como anticuerpos de neutralización cruzada consistentes y persistentes contra Omicron BA.1 y BA.4/5. También medimos la inducción de altos niveles de células B de memoria específicas de Spike (ancestral D614 y Omicron BA.4/5) 1 año después de la inmunización con las tres formulaciones. Además, la combinación de los dos antígenos (D614 y Beta CoV2 preS dTM) en la formulación de la vacuna bivalente no redujo la inmunogenicidad de ninguno de los antígenos en comparación con las formulaciones monovalentes. Las extensas respuestas de neutralización cruzada inducidas por la formulación bivalente pueden explicarse por los efectos aditivos de los dos componentes de la vacuna, que muestran perfiles opuestos con respecto a la neutralización de las variantes. De hecho, la vacuna monovalente D614 induce Abs de neutralización cruzada contra D614G, Alpha y Delta que contienen el aminoácido E484 original, mientras que la vacuna monovalente Beta induce Abs de neutralización cruzada contra Gamma y Mu que contienen la mutación E484K responsable de la mayor parte del escape de anticuerpos20 . La neutralización consistente de la variante Omicron mucho más distante (con mutación E484A) podría ser el resultado de un efecto complementario o sinérgico hacia epítopos conservados que podrían ser subdominantes en cada vacuna monovalente39,40.

Para complementar los resultados de neutralización, los extensos análisis serológicos del sistema indicaron que la formulación bivalente provocó subclases de IgG y funciones Fc similares en general en comparación con cada formulación monovalente.

Curiosamente, cuando comparamos el régimen de inmunización de dos dosis con la vacuna bivalente con regímenes de inmunización heterólogos alternativos, con monovalente D614 seguido de monovalente Beta o vacunas bivalentes, solo la segunda inyección con monovalente Beta indujo respuestas neutralizantes equilibradas, y con una mayor variabilidad que dos dosis con la vacuna bivalente. El rendimiento más bajo de la preparación/refuerzo heterólogo también se observó en ratones en los que se indujeron nAb más bajos (ancestral, Alfa, Beta y Gamma) con vacunación heteróloga con vacuna S-trimer (D614 en D0 y Beta en D21), en comparación con dos -dosis con una vacuna bivalente41. La amplitud limitada de respuestas observada en nuestro estudio con el régimen heterólogo D614/Beta contrasta con la amplitud ampliada de respuestas neutralizantes observadas recientemente después de una vacuna de refuerzo tardía en NHP y humanos14,15,16. Esto probablemente se relaciona con la ausencia de maduración de la población de células B de memoria cuando la segunda inyección se realiza poco después de la inmunización de preparación (3 semanas aquí en comparación con 6 meses a 1 año en el contexto de una vacunación de refuerzo)42,43. Mientras que en el régimen heterólogo de cebado/refuerzo bivalente D614, el perfil de Ab D614 observado corresponde al "pecado antigénico original", donde la primera exposición determina las respuestas Ab provocadas por las vacunas de refuerzo44,45, en el contexto de la vacunación de refuerzo COVID, el la inmunización primaria activa eficientemente los centros germinales que luego generan respuestas Ab más amplias con el tiempo46.

El estudio mostró estabilidad de los títulos neutralizantes entre 3 y 12 meses con las diferentes formulaciones de vacuna CoV2 preS dTM-AS03 después de una serie primaria de dos dosis. Esto contrasta con la disminución continua de nAb observada con la vacuna mRNA-1273 durante un período similar (hasta D209) en humanos47.

Hasta donde sabemos, estos son los primeros datos que muestran una neutralización cruzada extensa que cubre todos los VOC emergentes hasta 12 meses en NHP después de una inmunización primaria de dos dosis. Estudios anteriores demostraron que las candidatas a vacunas basadas en nanopartículas o bivalentes podían inducir respuestas de anticuerpos neutralizantes equilibradas contra los VOC, pero los datos se limitaron a ratones o se documentaron en un panel más limitado de variantes41,48,49,50. Otros candidatos, basados ​​en nanopartículas de ferritina Spike o nanopartículas de ferritina RBD, mostraron una amplitud similar contra el SARS-CoV-1 y la durabilidad Ab; sin embargo, estos candidatos se encuentran en etapas más tempranas de desarrollo clínico51,52,53. Los estudios futuros sobre células plasmáticas de larga vida y compartimentos de células B de memoria estarían justificados para comprender mejor la durabilidad de las respuestas Ab con ARNm y vacunas basadas en proteínas.

En este estudio, también mostramos la eficacia de la vacuna en hámsters donde la formulación de la vacuna bivalente que contiene Beta protegió de la patología pulmonar y la replicación viral después de un desafío con las variantes D614G, Alpha y Beta. La protección contra la infección y la patología se observó en animales con títulos reducidos de anticuerpos de neutralización cruzada provocados por la inmunización con las formulaciones monovalentes, lo que respalda la ausencia de enfermedad mejorada en el contexto de la infección heteróloga. Es de destacar que dos hámsteres en el grupo de la vacuna monovalente D614 mostraron títulos bajos de unión de anticuerpos (ELISA) y títulos de anticuerpos neutralizantes no detectables, 2 semanas después de la segunda dosis. Estas observaciones se correlacionaron con signos clínicos de infección después del desafío (pérdida de peso, replicación viral y patología pulmonar). Un análisis exploratorio indicó que la protección contra la patología se asoció con títulos de anticuerpos neutralizantes detectables; sin embargo, no se pudo identificar ningún umbral. Serían necesarios estudios futuros para definir los umbrales de protección para las variantes54,55 y para explorar el papel de las respuestas de células T de reacción cruzada provocadas por la vacuna en la protección de la vacuna56.

Aunque los estudios presentados aquí incluyeron un número bajo de animales por grupo y evaluaron la protección poco después de la inmunización, los resultados se confirmaron recientemente en un ensayo clínico de gran eficacia (NCT04904549), donde se demostraron altos niveles de protección contra la infección sintomática de Omicron después de la inmunización primaria con la vacuna beta bivalente CoV2 preS dTM-AS0357. Curiosamente, en otros dos ensayos clínicos de fase 3 (NCT04762680, NCT05124171), la vacuna Beta monovalente CoV2 preS dTM-AS03 mostró una superioridad significativa a la vacuna basada en D614 en el refuerzo de nAbs de Omicron en adultos previamente preparados con vacunas de ARNm COVID-1916,17 .

Teniendo en cuenta la evolución viral rápida continua que selecciona variantes de escape inmunitario, tanto la población ingenua, como los jóvenes o los que aún no han sido vacunados, como la población previamente vacunada, podrían beneficiarse de las respuestas inmunitarias amplias y duraderas conferidas por el CoV2 preS que contiene Beta. Formulaciones de vacunas dTM-AS03.

Las secuencias de proteínas están disponibles en GISAID utilizando los códigos de acceso proporcionados en el manuscrito: B.1.351 secuencias GISAID Acceso EPI_ISL_1048524. Los datos de origen generados en este estudio se proporcionan como Datos complementarios 1. Todos los demás datos estaban disponibles del autor correspondiente (u otras fuentes, según corresponda) previa solicitud razonable.

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Los miembros del equipo de histopatología e IHC de Sanofi Global Discovery Pathology (TIM) por su excelente ayuda técnica en los procedimientos de histología e IHC en las muestras de pulmón de hámster. Los autores agradecen a Jon Smith por coordinar la producción y proporcionar los antígenos de la vacuna para el estudio, Caroline Patriarca- Ruat por la gestión del proyecto, y Carlos Diaz-Granados, Stephen Savarino y Saranya Sridhar por las discusiones críticas sobre los diseños del estudio y el análisis de datos. Los autores agradecen a Dean Huang por probar los sueros de hámster en ELISA y a Julie Piolat por el apoyo de los análisis estadísticos. Los autores también agradecen a Isabel Grégoire, Hardik Ashar, Priya Upadhyay y Hanson Geevarghese (Sanofi) por brindar asistencia editorial y coordinación del artículo. Este trabajo se realizó en colaboración con GSK, que proporcionó acceso y uso del sistema adyuvante AS03. El financiamiento fue proporcionado en parte por Sanofi y por la Autoridad de Investigación y Desarrollo Biomédico Avanzado (BARDA), Administración para la Preparación y Respuesta Estratégicas del Departamento de Salud y Servicios Humanos de los EE. Oficina Ejecutiva del Programa Conjunto para la Defensa Química, Biológica, Radiológica y Nuclear bajo el Contrato # W15QKN-16-9-1002.

Estos autores contribuyeron igualmente: Catherine Berry, Vincent Pavot.

Sanofi, I+D de vacunas, Marcy l'Etoile, Francia

Catherine Berry, Vincent Pavot, Alice Raillard, Sylviane Gautheron y Valerie Lecouturier

Sanofi, Investigación y desarrollo de vacunas, Cambridge, MA, EE. UU.

Natalie G. Anosova, Michael Kishko, Lu Li, Tim Tibbitts y Roman M. Chicz

Sanofi, Framingham, MA, EE. UU.

Sheila Cummings y Dinesh S. Bangari

BIOQUAL Inc, Rockville, MD, EE. UU.

Kar Swagata

Instituto Ragon de MGH, MIT y Harvard, Cambridge, MA, EE. UU.

Caroline Atyeo, Yixiang Deng y Galit Alter

GSK, Rixensart, Bélgica

Cindy Gutzeit

GSK, Wavre, Bélgica

marguerite koutsoukos

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VL, TT, CB, VP, AR, SG, NGA, RMC, CG, M.Ko, CA y GA contribuyeron al concepto o diseño del estudio. MK, SG, AR, SG, DSB, SK y CA contribuyeron a realizar el estudio y el análisis de muestras. VL, TT, CB, VP, AR, SG, NGA, RMC, CG, MK, CA, GA, CG y M.Ko participaron en la interpretación de los datos y la revisión del manuscrito. VL, VP y CB redactaron el primer manuscrito.

Correspondencia a Valerie Lecouturier.

CB, VP, NGA, MK, DH, TT, AR, SG, DSB, RMC y VL son empleados de la empresa Sanofi y pueden poseer acciones. SC era un empleado de Sanofi en el momento de la realización del estudio y actualmente está empleado en AbbVie y posee acciones de Sanofi. SK es un empleado de Bioqual y no informa conflictos. GA es cofundador y se desempeña como consultor de SeromYx Systems Inc y tiene una patente pendiente a través de SeromYx Systems Inc. CA y GA eran empleados del Instituto Ragon de MGH, MIT y Harvard en el momento de realizar el estudio y actualmente están empleados en Moderna. YD no tiene nada que revelar. M.Ko y CG son empleados del grupo de empresas GSK y declaran ser propietarios de acciones de GSK.

Communications Medicine agradece a Teresa Aydillo-Gomez y a los otros revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Los informes de los revisores están disponibles.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Acceso abierto Este artículo tiene una licencia internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, el intercambio, la adaptación, la distribución y la reproducción en cualquier medio o formato, siempre que se otorgue el crédito correspondiente al autor o autores originales y a la fuente. proporcionar un enlace a la licencia Creative Commons e indicar si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la regulación legal o excede el uso permitido, deberá obtener el permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Berry, C., Pavot, V., Anosova, NG et al. La vacuna de proteína SARS-CoV-2 bivalente que contiene beta provoca una amplia neutralización duradera en macacos y protección en hámsteres. Commun Med 3, 75 (2023). https://doi.org/10.1038/s43856-023-00302-z

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Recibido: 19 Agosto 2022

Aceptado: 09 mayo 2023

Publicado: 26 mayo 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s43856-023-00302-z

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